1．多肽合成歷史回顧

多肽化學(xué)已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先化學(xué)方法合成了自由的二肽。由于當時在多肽合成方面的知識太少，進展也相當緩慢當時合成采用了苯甲酰，乙酰保護，脫去相當困難，而且容易導(dǎo)致肽鏈斷裂。1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基（Z）來保護α-氨基，該保護基可以在催化氫化或氫溴酸的條件下定量脫除，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀50年代，隨著越來越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)，大大推動了有機化學(xué)家們對多肽合成方法以及保護基的研究，因此這一階段的研究成果也非常豐富，人們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素（Oxytocin），胰島素等，同時在多肽合成方法以及氨基酸保護基上面也取得了不少成績，這為后來的固相合成方法的出現(xiàn)也提供了實驗和理論基礎(chǔ)。也就是這個階段，F(xiàn)red Sanger發(fā)明了氨基酸序列測定方法，并為此獲得了1958年的Nobel化學(xué)獎。他后來還發(fā)明了DNA序列檢測方法，并于1980年再次獲得了Nobel化學(xué)獎，成為到目前為止唯一獲得兩次Nobel化學(xué)獎的科學(xué)家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），這個在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出來，就由于其合成方便，迅速，現(xiàn)在已經(jīng)成為多肽合成的首選方法，隨后的發(fā)展也證明了該方法不僅僅是一種合成方法，而且也帶來了有機合成上的一次革命，并成為了一支獨立的學(xué)科，固相有機合成（SPOS）。當然，Merrifield也因此榮獲了1984年的Nobel化學(xué)獎。也正是Merrifield，他經(jīng)過了反復(fù)的篩選，最終屏棄了芐氧羰基（Z）在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（Boc）用于保護α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性條件下定量的脫除，反應(yīng)也非常迅速，在30min就可以反應(yīng)完全。由于叔丁氧羰基（Boc）方法中，氨基酸側(cè)鏈的保護基團大多基于芐基（Bzl），因此也稱為BOC-Bzl策略。同時，Merrifield在20世紀60年代末發(fā)明了第一臺全自動多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124個氨基酸）。隨后的多肽化學(xué)研究主要集中在固相合成樹脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護基的研究。1972，Lou Carpino 首先將9-芴甲氧羰基（Fmoc）用于保護α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，到了20世紀80年代取代了叔丁氧羰基（Boc），成為了固相多肽合成中的首選合成方法。該方法中氨基酸的側(cè)鏈大多基于叔丁基（tBu），因此，也稱為Fmoc-tBu策略。同時，在多肽合成樹脂，縮合試劑以及氨基酸保護，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護上也取得了豐碩的成果。 進入21世紀，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入，對于多肽化學(xué)的要求不僅僅是改進合成方法，而更多的集中肽庫的設(shè)計、多肽藥物的大規(guī)模制備、多肽標記與修飾、以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成以及長肽或蛋白合成。 

2．多肽合成的基礎(chǔ)知識 

多肽化學(xué)合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現(xiàn)在主要采用Boc和Z兩種保護方法，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產(chǎn)素等，其相對與固相合成，具有保護基選擇多，成本低廉，合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點。與固相合成比較，液相合成主要缺點是，合成范圍小，一般都集中在10個氨基酸以內(nèi)的多肽合成，還有合成中需要對中間體進行提純，時間長，工作量大。固相合成方法現(xiàn)在主要采用Fmoc和Boc兩種方法，它具有合成方便，迅速，容易實現(xiàn)自動化，而且可以比較容易的合成到30個氨基酸左右多肽。 
2.1．氨基酸保護基
    20種常見氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側(cè)鏈氨基酸（His，Arg， Lys），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護非常關(guān)鍵，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。因為常見的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進行保護，一般要求，這些保護基在合成過程中穩(wěn)定，無副反應(yīng)，合成結(jié)束后可以完全定量的脫除。合成中需要進行保護的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進行保護的基團：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護，象Trp，Asn，Gln，Thr，Tyr。 

圖1 常見3種氨基保護基結(jié)構(gòu)

氨基酸側(cè)鏈保護基團非常多，同一個側(cè)鏈有多種不同的保護基，可以在不同的條件下選擇性的脫除，這點在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側(cè)鏈保護基和選擇的合成方法有密切的關(guān)系，液相和固相不一樣，固相中Boc和Fmoc策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學(xué)就是氨基酸保護基的靈活運用與搭配。關(guān)于側(cè)鏈保護基的使用，請參考黃惟德《多肽合成》的有關(guān)章節(jié)，這里簡單介紹Cys，Lys，Asp的幾種保護基及其脫除方法。Cys最常見的保護基有三種，Trt，Acm，Mob，這三個保護基可以完成多對二硫鍵多肽的合成。Lys最常見的保護基有：Boc，F(xiàn)moc，Trt，Dde，Alloc，這對于固相合成環(huán)肽提供了很多正交的保護策略。Asp最常見的保護基有：OtBu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同樣也提供了多種正交的保護策略。

表1 巰基常見保護基

更多信息見附件PDF文件。