1、多肽合成的基本原理?

多肽固相合成法是多肽合成化學(xué)的一個(gè)重大的突破。它的最大特點(diǎn)是不必純化中間產(chǎn)物，合成過程可以連續(xù)進(jìn)行，進(jìn)而為多肽合成的自動(dòng)化奠定了基礎(chǔ)。目前全自動(dòng)多肽的合成，基本都是固相合成。其基本過程如下：

基于Fmoc化學(xué)合成，先將所要合成的目標(biāo)多肽的C-端氨基酸的羧基以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點(diǎn)，同其它的氨基酸已經(jīng)活化的羧基作用形成肽鍵，不斷重復(fù)這一過程，即可得到多肽。根據(jù)多肽的氨基酸組成不同，多肽后處理方式不同，純化方式也有差異。

2、做免疫用的多肽多長(zhǎng)為合適?

答：一般約10-15個(gè)氨基酸，當(dāng)然長(zhǎng)一些免疫效果好一些，不過合成費(fèi)用也會(huì)增加。MAP多肽則希望長(zhǎng)度在15aa以上，效果較好。另外，10aa以下的多肽免疫效果比較差。

3、免疫用多肽的純度需要很高嗎?

答：一般而言， 免疫用Peptide，70-85%即可。

4、我們合成的多肽溶解性不好，多肽就有問題對(duì)嗎?

答：很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)一個(gè)多肽的溶解性及合適的溶劑是什么。如果多肽難以溶解就認(rèn)為多肽合成有問題這個(gè)觀念并不正確。

5、多肽狀態(tài)是如何?如何保存儲(chǔ)存?

答：我們提供的多肽是粉末狀，一般為灰白色，組成不同，多肽粉末的顏色有差異，多肽一般長(zhǎng)期保存需要避光保存，并應(yīng)保存在-20度，短期可以保存在4度。可以短時(shí)間的話是以室溫運(yùn)輸。

6、如何溶解多肽?

答：溶解多肽是非常復(fù)雜的事情，一般很難一下子確定合適的溶劑。通常是先取一點(diǎn)試驗(yàn)，在沒有確定合適的溶劑前千萬不要全部溶解。

下列方法有助于您選擇合適的溶劑：

(1)判定多肽的電荷特定，設(shè)定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH為-1；堿性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2為+1,其它氨基酸的電荷為0。計(jì)算出凈電荷數(shù)。

(2)如果凈電荷數(shù) >0，多肽為堿性，用水溶解：如果不溶解或溶解性不大，加入醋酸(10%以上)；如果多肽還不能溶解，加入少量TFA(25ul)溶解，然后加入500ul水稀釋。

(3)如果凈電荷數(shù)<0，多肽為酸性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入氨水(25ul)溶解，然后加入500ul水稀釋。

(4)如果凈電荷數(shù)=0，多肽為中性，一般需要用有機(jī)溶劑如乙腈，甲醇或異丙醇，DMSO等溶解。還有人建議需要尿素來溶解疏水性很大的多肽。

7、非HPLC純化的多肽中有哪些雜質(zhì)?

答：粗品和脫鹽級(jí)別的多肽中多肽和非多肽類雜質(zhì)：如非全長(zhǎng)多肽和多肽后處理的一些原料如DTT、TFA等

8、HPLC純化的多肽有哪些雜質(zhì)?

答：經(jīng)過HPLC純化的多肽，仍會(huì)有一些雜質(zhì)存在，其中的雜質(zhì)主要是短肽和微量TFA。

9、多長(zhǎng)的多肽為合適?

答：多肽合成需要考慮多肽的長(zhǎng)度，電荷，親疏水性等因素。長(zhǎng)度越長(zhǎng)，合成粗品的純度和產(chǎn)率都隨著降低，純化的難度和無法合成的幾率就會(huì)大些。當(dāng)然多肽功能區(qū)的序列是無法改變的，但是為了多肽的順利合成，有時(shí)不得不在功能區(qū)的上下游增加一些輔助氨基酸，以改善多肽的溶解性和親疏水性。如果多肽太短，合成也可能有問題，主要問題是合成的多肽在后處理過程中有一定的難度，5肽以下的多肽，一般要有疏水的氨基酸，否則后處理難度加大。15個(gè)氨基酸殘基以下的多肽一般都可以得到滿意的產(chǎn)率和得率。

10、如何從多肽序列中判定多肽的溶解性?

(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很強(qiáng)的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp，多肽很難溶解于水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無論是純化或合成，都有可能有問題。

(2)一般情況下疏水性氨基酸的比例<50%，不能連續(xù)5個(gè)連續(xù)aa為疏水性，帶電荷的氨基酸的(正電荷K,R,H,N-terminus,負(fù)電荷D,E,C- terminus)的比例達(dá)到20%，在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸，也可以改善溶解性。

11、為什么含有Cys,Met,或Trp的多肽難合成?

答：含有Cys, Met,或Trp的多肽難以合成，同時(shí)難以獲得高純度的產(chǎn)品。主要因?yàn)檫@些基團(tuán)不穩(wěn)定，易氧化。這些多肽的使用和儲(chǔ)存都需要特別注意，避免反復(fù)開啟蓋子。

12、為什么有些多肽的合成產(chǎn)率或純度會(huì)比較低?

答：多肽合成與引子合成有比較大的區(qū)別，不能合成的引子很少，但是不能合成的多肽經(jīng)常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr這些氨基酸比鄰或重復(fù)時(shí)，多肽鏈在合成過程中不能完全舒展溶解，合成效率下降。以下幾種情形，合成效率和產(chǎn)物的純度都比較低，如：重復(fù)Pro,Ser-Ser，重復(fù)Asp，4個(gè)連續(xù)Gly等。

13、多肽是如何純化的?

答：多肽純化一般使用反相柱(如C8，C18等)，214nm。緩沖體系通常為含TFA的溶劑，pH 2.0 。Buffer A為含0.1%TFA in ddH2O，Buffer B為1%TFA/ACN/ pH 2.0。純化前用Buffer A溶解；如果溶解不好，用Buffer B溶解后，然后用Buffer A稀釋；對(duì)疏水性強(qiáng)的多肽，有時(shí)還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗產(chǎn)物，如果多肽不長(zhǎng)(15aa以下)，一般會(huì)有主峰，主峰通常為全長(zhǎng)產(chǎn)物；對(duì)于20aa以上的長(zhǎng)肽，如果沒有主峰，HPLC需搭配Mass來判定分子量，進(jìn)而確定哪個(gè)峰是所要合成的多肽。

14、茚三酮檢測(cè)是如何檢測(cè)的？

固相多肽合成中，主要是通過檢測(cè)樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測(cè)方法稱為Kaiser方法，其檢測(cè)結(jié)果，如果有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。

Kaiser試劑包括：

A，6% 茚三酮的乙醇溶液

B，80% 苯酚的乙醇溶液

C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要經(jīng)過茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測(cè)過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。

還有其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。

15、困難序列多肽合成的改善方法有哪些？

固相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題，這里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因?yàn)橛行┒嚯男蛄性跇渲闲纬?beta;-折疊，改變了樹脂的溶脹性能，還有可能將反應(yīng)的活性位點(diǎn)埋藏在樹脂里面，這樣使得反應(yīng)很難進(jìn)行，目前報(bào)道使用的主要方法有：1，使用混合溶劑，DMSO/DMF，6N 胍啶/DMF溶液。2，提高反應(yīng)溫度，或采用微波方法。3，使用高離液鹽，LiCl，NaClO4等。4，使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂，同時(shí)減少樹脂擔(dān)載量（0.05-0.2mmol/g）。

16，N末端的生物素標(biāo)記的合成步驟？

Wash 0.1 mmol resin with DMF.

Dissolve 0.244 g (+)-biotin (1 mmol, MW 244.3) in 5 mL DMF-DMSO (1:1) solution. A little warming is necessary.

Add 2.1 mL 0.45 M HBTU/HOBt solution and 0.3 mL DIEA to the solution prepared in step 2.

Add the activated biotin solution to the resin and let stir overnight.

Check resin to make sure coupling is complete as evidenced by negative ninhydrin test (colorless).

Wash resin with DMF-DMSO (1:1) (2x) to remove excess (+)-biotin.

Wash resin with DMF (2x) and DCM (2x).

Let the resin dry before proceeding to cleavage.

17、在2-氯TRT樹脂上掛第一個(gè)FMOC氨基酸的方法？

Weigh 10 g 2-chlorotrityl chloride resin (15 mmol) in a reaction vessel, wash with DMF (2x), swell the resin in 50 mL DMF for 10 min, drain vessel.

Weigh 10 mmol Fmoc-amino acid in a test tube, dissolve Fmoc-amino acid in 40 mL DMF, transfer the solution into the reaction vessel above, add 8.7 mL DIEA (50 mmol), swirl mixture for 30 min at room temperature.

Add 5 mL methanol into the reaction vessel and swirl for 5 min.

Drain and wash with DMF (5x).

Check substitution.

Add 50 mL 20% piperidine to remove the Fmoc group. Swirl mixture for 30 min.

Wash with DMF (5x), DCM (2x), put resin on tissue paper over a foam pad and let dry at room temperature overnight under the hood. Cover the resin with another piece of tissue paper, press lightly to break aggregates.

Weigh loaded resin.

Pack in appropriate container.

18、檢測(cè)樹脂上面是否掛上第一個(gè)FMOC氨基酸的方法？

Weigh duplicate samples of 5 to 10 mg loaded resin in an eppendorf tube, add 1.00 mL 20% piperidine/DMF, shake for 20 min, centrifuge down the resin.

Transfer 100 µL of the above solution into a tube containing 10 mL DMF, mix well.

Pipette 2 mL DMF into each of the two cells (reference cell and sample cell), set spectrophotometer to zero. Empty the sample cell, transfer 2 mL of the solution from step 2 into the sample cell, check absorbance.

Subs = 101(A)/7.8(w)

A = absorbance

w = mg of resin

Check absorbance three times at 301 nm, calculate average substitution.

19、FMOC方法合成多肽操作步驟 (0.25 mmol)？

Wash resin with DMF (4x) and then drain completely.

Add approximately 10 mL 20% piperidine/DMF to resin. Shake for one min and drain.

Add another 10 mL 20% piperidine/DMF. Shake for 30 min.

Drain reaction vessel and wash resin with DMF (4x). Make sure there is no piperidine remaining. Check beads using ninhydrin test, beads should be blue.

Coupling Step - Prepare the following solution:

1 mmol Fmoc-amino acid

2.1 mL 0.45 M HBTU/HOBT (1mmol)

348 µL DIEA (2 mmol)

Add above solution to the resin and shake for a minimum of 30 min. This coupling step can be longer if desired.

Drain reaction vessel and wash resin with DMF (4x).

Perform Ninhydrin test:

If negative (colorless), proceed to step 2 and continue synthesis.

If positive (blue), return to step 5 and re-couple the same Fmoc-amino acid. Increase the coupling time if necessary.