摘要:

本文設(shè)計(jì)可活化細(xì)胞穿膜肽 (activatable cell-penetrating peptide, ACPP), 對(duì)合成的 ACPP 進(jìn)行酶解研究。ACPP 由 3 部分連接而成, 寡聚陰離子序列肽-基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP) 的底物肽-寡聚陽離子序列肽。采用反相高效液相色譜 (reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) 監(jiān)測(cè) 37 ℃條件下 IV 型膠原酶 (含 MMP-2 和 MMP-9) 對(duì) ACPP 的酶解過程。收集酶解成分進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (matrix assisted laser desorption ionization orthogonal time of flight mass spectrometry, MALDIO-TOF-MS) 檢測(cè), 比對(duì)推測(cè)酶解碎片的序列。結(jié)果表明, ACPP 可被 IV 型膠原酶裂解, 釋放出寡聚陽離子序列肽, 即細(xì)胞穿膜肽 (cell-penetrating peptide, CPP), ACPP 裂解一半的時(shí)間約為 4 h。酶解發(fā)生于目標(biāo)位點(diǎn), 但不排除 ACPP 裂解后肽段的再次斷裂。

在研究中發(fā)現(xiàn)越來越多的肽類、蛋白類及核酸類等生物活性物質(zhì)具有很好的藥理作用。絕大多數(shù)的生物大分子因其分子的大小、所帶電荷、極性以及細(xì)胞膜的屏障作用不能通過被動(dòng)擴(kuò)散穿透生物膜, 細(xì)胞對(duì)于這類分子的攝取非常少。因此, 缺乏穿透細(xì)胞膜并到達(dá)細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的能力是肽類、蛋白類及核酸類藥物發(fā)展和使用的一個(gè)嚴(yán)重的障礙[1]。

將難進(jìn)入細(xì)胞的生物活性分子與細(xì)胞穿膜肽(CPP) 通過化學(xué)連接或物理集合的形式, 以非侵襲性的方式穿透細(xì)胞膜, 克服細(xì)胞對(duì)親水生物活性物質(zhì)攝取太少的難題, 是目前藥物運(yùn)輸系統(tǒng)的重要研究方向[1−4]。這種由多肽介導(dǎo)的生物活性分子的運(yùn)輸, 具有效率高、毒性低, 而且多肽主鏈具有可修飾性, 在很多方面都優(yōu)于傳統(tǒng)的方法。然而, CPP 缺乏組織和細(xì)胞的特異性[3], 作為藥物載體的應(yīng)用過于復(fù)和難于控制, 存在靶細(xì)胞攝取效率低及體內(nèi)吸收、分布、生物利用度和毒性等方面問題, 嚴(yán)重限制了其作為藥物運(yùn)輸工具的應(yīng)用。針對(duì)這個(gè)難題, 可活化的細(xì)胞穿膜肽 (activatable CPP, ACPP) 應(yīng)運(yùn)而生[5]。利用 ACPP 選擇性地將生物大分子運(yùn)送到癌細(xì)胞是一種全新的藥物運(yùn)輸思路。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的 MMP-2 和/或 MMP-9已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中高表達(dá), 包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、膀胱癌和前列腺癌等, 但在正常組織中表達(dá)微弱。MMP-2 和 MMP-9 的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力相關(guān)。在侵襲性腫瘤細(xì)胞中 MMP-2 和 MMP-9 的表達(dá)水平較高, 能降解 IV型膠原 (血管基底膜的主要成分、轉(zhuǎn)移的主要生理屏障), 與腫瘤的血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)[6, 7]?；谝陨峡紤], 本研究設(shè)計(jì)了以MMP-2和MMP-9為靶酶的ACPP, 采用RP-HPLC和MALDIO-TOF-MS, 研究了 ACPP 的酶解反應(yīng)行為并對(duì)酶解產(chǎn)物的多肽片段進(jìn)行序列推測(cè), 判斷酶解位點(diǎn)。

材料與方法

材料與儀器 乙腈 (色譜純, 天津西華特種試劑廠)、IV 型膠原酶 (Sigma, USA)。高效液相色譜儀 (Agilent 1100 Series, USA)、Diamonsil C18 色譜柱(250.0 mm × 4.6 mm, 5 μm)、MALDI-TOF 質(zhì)譜儀(Waters MALDI Micro MX, USA)。ACPP 的設(shè)計(jì)與合成 ACPP 的序列由 3 部分組成, 如圖 1 所示的 A 段、B 段和 C 段, 序列為E-E-E-E-E-X-P-L-G-L-A-G-R-R-R-R-R-R-X-K-C, 分子式 C106H188O32N40S, 相對(duì)分子質(zhì)量為 2 566.94。

A 段序列 R-R-R-R-R-R-X-K-C 為 ACPP 的活性中心 (CPP 區(qū)), 5 個(gè)精氨酸組成的序列帶正電荷, 具有細(xì)胞膜穿透功能[1]。B 段序列 P-L-G-L-A-G 為MMP-2 和 MMP-9 的識(shí)別位點(diǎn), 并可被 IV 型膠原酶(主要為 MMP-2 和 MMP-9) 特異性斷裂[4−10]。C 段序列 E-E-E-E-E-X 帶負(fù)電荷, C 段的功能為通過中和 A段的正電荷來封閉 A 段的細(xì)胞膜穿透活性。

帶負(fù)電荷的 C 段序列屏蔽了 A 段序列的正電荷, 由寡聚精氨酸構(gòu)成的 CPP 的活性被具有負(fù)電荷的氨基酸構(gòu)成的抑制性多肽區(qū)掩蓋, 暫時(shí)失去細(xì)胞膜穿透功能, 當(dāng)帶正電的寡聚陽離子區(qū)和帶負(fù)電的寡聚陰離子區(qū)之間的連接區(qū)域 (P-L-G-L-A-G) 被蛋白酶裂解時(shí), 釋放出 CPP 從而發(fā)揮功能。這種復(fù)合細(xì)胞穿膜肽稱為 可活 化細(xì)胞 穿膜 肽 (activatable cellpenetrating peptide, ACPP)。

ACPP。采用常規(guī) Fmoc 固相合成法逐步連接單氨基酸直到形成目標(biāo)序列, 用茚三酮法驗(yàn)證每一步氨基酸縮合與脫保護(hù)的正確性。粗肽經(jīng)RP-HPLC純化。MALDI-TOF-MS檢測(cè)驗(yàn)證合成多肽分子量的正確性, 以確保一級(jí)結(jié)構(gòu)序列正確。

酶解反應(yīng)分析 將 ACPP 粉末 0.5 mg 溶于蒸餾水 500 μL中, 得到質(zhì)量濃度為 1.00 mg·mL−1的 ACPP儲(chǔ)備液。用蒸餾水將儲(chǔ)備液分別稀釋為 0.571、0.612、0.714、0.833 和 1.00 mg·mL−1 的 ACPP 水溶液。ACPP儲(chǔ)備液與 IV 型膠原酶儲(chǔ)備液混合, 二者終濃度分別為 0.571 和 2.2 mg·mL−1 (濃度比為 0.26), 在 37 ℃水浴條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。在反應(yīng)過程對(duì)酶解體系取樣, 進(jìn)行 HPLC 分析。流動(dòng)相: A-水 (0.1% TFA); B-乙腈 (0.1% TFA); 程序: 在 0～40 min 內(nèi) B 由 5%至70%; 流速: 1 mL·min−1; 紫外檢測(cè)參數(shù): 214 nm; 進(jìn)樣量: 20 μL。收集 HPLC 分離的成分, 凍干, 進(jìn)行MALDI-TOF-MS 檢測(cè)[11]。解析 HPLC 分離組分的MALDI-TOF-MS 結(jié)果。采用人工比對(duì)的方法對(duì) ACPP的酶解產(chǎn)物多肽片段進(jìn)行序列推測(cè)[12, 13]。

結(jié)果與討論

1 ACPP 的合成與驗(yàn)證
ACPP 合成后, 采用 MALDI-TOF-MS 檢測(cè)驗(yàn)證合成多肽分子量的正確性, 結(jié)果如圖 2。m/z 實(shí)驗(yàn)值為2 566.49 (2 567.49 為[M+H]+峰) 與理論值2 566.94相符, 說明合成的多肽正確。經(jīng) HPLC 檢測(cè) ACPP 純度>99%。

2 酶解反應(yīng)
HPLC 檢測(cè) ACPP 的峰位和酶解反應(yīng)后的圖譜變化情況, 不同濃度的 ACPP 溶液都在 14.8 min 左右處有吸收峰 (圖 3A)。峰高和峰面隨 ACPP 溶 液濃度的升高而增大, 峰面積與 ACPP 濃度呈線性關(guān)系 (圖 4), MALDI-TOF-MS 檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為2 567.24 [M+H]+?？梢远?14.8 min 的峰即為 HPLC實(shí)驗(yàn)條件下 ACPP 的特征吸收峰。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng), 出現(xiàn)降解產(chǎn)物的峰 (圖 3B), ACPP 的峰面積逐漸減少 (圖 5)。37 ℃時(shí), ACPP 降解一半的時(shí)間 (T1/2) 約為 4 h。

分別收集 TR為7.9, 12.3 和15.1 min 的3 個(gè)峰, 凍干, 進(jìn)行 MALDI-TOF-MS 檢測(cè)。通過 MALDI-TOFMS 解析及序列推測(cè), 在 TR為 7.9 min 的峰中有序列為 G-R-R-R-R-R-R 多肽片段的[M+Na]+峰 (m/z 理論值為 1 012.27, 實(shí)驗(yàn)值為 1 012.54); G-R-R-R-R-R 多肽片段的[M+Na]+峰 (m/z 理論值為 856.07, 實(shí)驗(yàn)值為 856.49)。在 TR 為 12.3 min 的峰中有序列為 P-LG-L-A-G-R-R-R-R的多肽片段的[M+H]+峰 (m/z理論值為 1 151.50, 實(shí)驗(yàn)值為 1 150.67); E-E-E-E-E-X-P 多肽片段的 [M+H]+和 [M+Na]+峰 (m/z 理論值為873.98, 實(shí)驗(yàn)值為 873.49); E-E-E-E-E-X-P-L 多肽片段的[M+K]+峰 (m/z 理論值為 987.15, 實(shí)驗(yàn)值為986.55); E-E-E-E-X-P-L-G-L-A 多肽片段的[M+K]+峰(m/z 理論值為 1 099.35, 實(shí)驗(yàn)值為 1 099.69)。在 TR為 15.1 min 的峰中有序列為E-E-E-E-E-X-P-L-G 多肽片段的[M+Na]+峰 (m/z 理論值為1 044.22, 實(shí)驗(yàn)值為1 043.6)。

IV型膠原酶的主要成分為MMP-2和MMP-9[7−11], 有文獻(xiàn)報(bào)道可以特異性斷裂 P-L-G-L-A-G 序列[8−10]或其類似序列[8−11]。IV 型膠原酶有效地裂解了 ACPP, 酶解成分中含寡聚精氨酸序列可以發(fā)揮 CPP 的細(xì)胞穿透功能 (內(nèi)容另行發(fā)表)。該酶解反應(yīng)除了目標(biāo)位點(diǎn)的裂解外, 其他位點(diǎn)的裂解片段同時(shí)存在, 不排除是最初酶解多肽片段再斷裂的結(jié)果; IV 型膠原酶成分的多樣性也是造成分解位點(diǎn)較多的原因之一; 另外 ACPP 降解一半的時(shí)間 (T1/2) 約為 4 h, 進(jìn)行酶解產(chǎn)物分析是反應(yīng)體系進(jìn)行 23 h 后收集的分解產(chǎn)物峰, 反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)也是造成分解位點(diǎn)較多的另一原因, 但只要 B 段序列斷裂, 釋放出 CPP (A 段), 即可發(fā)揮CPP 的細(xì)胞穿透功能。