摘要: 內含肽是前體未成熟蛋白中的一段具有自我剪接功能的多肽鏈，在蛋白質純化、蛋白質連接、環(huán)肽制備、蛋白標記以及生物傳感器等方面廣泛應用。本文綜述了內含肽應用于蛋白質親和純化的發(fā)展歷程，分別對層析型和非層析型內含肽純化體系進行了分析和討論，并總結了對控制內含肽斷裂反應所進行的研究，為進一步改善內含肽介導蛋白質純化提供依據(jù)和線索。

1990年，蛋白質內含肽釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae VMA1被首次發(fā)現(xiàn)[1]。之后，隨著在不同細胞中發(fā)現(xiàn)越來越多的內含肽種類，內含肽作為一種新的分子生物學研究手段得到了更深入的研究。因內含肽在多肽鏈的剪接和斷裂反應中發(fā)揮著重要作用，使其在對蛋白的控制及修飾作用方面的應用也越來越廣泛。至今，蛋白質內含肽在蛋白質工程領域有著廣泛的應用。這些應用包括蛋白質純化、蛋白質連接、環(huán)肽制備、蛋白標記以及生物傳感器等方面。其中，蛋白質內含肽在蛋白純化方面的研究最為廣泛和深入。科學家們對不同種類的內含肽使用多種手段進行了探索。本文以這些探索經(jīng)驗為基礎，對內含肽在蛋白純化領域的應用進行分析總結，為找出一種最為有效的蛋白純化途徑提供依據(jù)。

1 內含肽簡介

蛋白質內含肽(又稱蛋白質內含子，Intein)是前體未成熟蛋白質中的一段多肽鏈，它通過一系列重排、轉酯、環(huán)化等自我催化的反應過程，可以從前體蛋白中切除并將兩端的蛋白多肽鏈(蛋白質外顯肽，Extein)通過一個天然的肽鍵連接，即通過蛋白質自我剪接作用實現(xiàn)蛋白質結構的重新布局[2-3]。斷裂內含肽是內含肽的一種結構類型。在結構上，它的N端區(qū)域(本文表示為IN)和C端區(qū)域(本文表示為IC)相互分離，而當IN和IC兩個片段連接恢復結構后可按照標準內含肽剪接途徑完成兩端外顯肽的拼接。

Perler FB將典型的蛋白質內含肽分為8個模塊，其中剪接結構域中包含A、B、F、G模塊，中間的歸巢核酸內切酶結構域則包含C、D、E、H模塊[4-5]。斷裂內含肽不含歸巢核酸內切酶結構域，因此只包含剪接結構域A、B、F、G模塊。這些模塊中存在一些比較保守的氨基酸殘基(圖 1)。而且，各模塊中的氨基酸一般為某一類性質的氨基酸，尤其是疏水氨基酸，這些氨基酸殘基在剪接或剪切反應過程中起著重要的作用[6]。例如，模塊A中首位氨基酸Cys1/Thr1/Ser1的羥基參與剪接反應第一步的?；嘏胚^程；模塊B中的Thr-His殘基可以與主鏈原子形成氫鍵并穩(wěn)定蛋白質構象，從而導致N端的酰基轉移反應的發(fā)生。C端部分的模塊G的倒數(shù)第二個殘基His通過與Asn形成氫鍵，并最終導致C端斷裂反應的發(fā)生。此外，一般通用的內含肽氨基酸位點從N端開始記為1，依次直到內含肽C端。N端外顯肽為負，與IN的N末端相連的開始記為-1。C端外顯肽為正，與IC的C末端相連的開始記為+1。

內含肽的剪接反應是一個不需要酶催化的自發(fā)進行的過程。它是經(jīng)4步親核反應完成的，包括：1) N-S?；嘏?Acyl rearrangement)；2)轉酯(Transesterification)反應；3)末位氨基酸Asn環(huán)化；4) S-N酰基重排。將內含肽的剪接反應改造成斷裂反應就是通過突變剪接結構模塊中的保守氨基酸，使剪接反應中的一部分不能進行而只能完成一端的斷裂[7]。另外，斷裂內含肽的IN和IC具有極強的相互識別能力[8]，兩者的親和結合是斷裂反應能夠進行的基礎。斷裂內含肽在構建親和純化系統(tǒng)中的應用就是基于內含肽的斷裂反應以及IN和IC片段之間親和識別結合原理實現(xiàn)的。

與其他親和純化系統(tǒng)(如免疫親和層析、金屬螯合親和層析)相比，內含肽介導的親和純化系統(tǒng)可以誘導斷裂反應的發(fā)生，使其在純化的過程中除去純化標簽并得到不含任何外來序列的目標蛋白。同時，也避免了使用其他手段除去純化標簽的麻煩。

2 內含肽親和純化系統(tǒng)發(fā)展簡史

經(jīng)過對內含肽親和純化系統(tǒng)的考察和分析，本文將內含肽親和純化系統(tǒng)應用的發(fā)展總結歸納為兩個時期。前期研究主要集中于對連續(xù)內含肽在親和純化中的應用；近期研究主要集中于斷裂內含肽在親和純化中的應用。

2.1 前期——連續(xù)內含肽時期

在內含肽應用于純化系統(tǒng)的早期，一般使用這種連續(xù)型內含肽作為純化輔助手段。通過氨基酸突變只保留一端斷裂活性的內含肽，與純化標簽和目標蛋白共同組合成前體蛋白。先借助純化標簽將前體蛋白從雜蛋白中純化出來，再利用內含肽一端的斷裂反應將目標蛋白從前體中切除并洗脫純化出來。

內含肽在親和純化中的應用最早在1997年。Ming等以C末端突變(Asn454Ala)的Sce VMA內含肽為基礎，在其C端連接CBD (Chitin binding domain)親和標簽并在N端連接目標蛋白構建純化體系進行蛋白純化[9]。Sce VMA內含肽是最早被發(fā)現(xiàn)的1種內含肽。利用這種內含肽構建了商品化的IMPACTTM-CN (NEB)蛋白表達純化體系。但這種內含肽的斷裂速率較慢，對于N端斷裂反應，23 ℃、有還原劑DTT誘導的條件下，達到95%的斷裂率需要16 h[9]。C端斷裂反應速率更低。而且，Sce VMA內含肽分子量較大(56 kDa)，不利于前體蛋白的可溶性表達。

后來又出現(xiàn)了經(jīng)過改造后的微小型連續(xù)內含肽mini-產(chǎn)甲烷嗜熱桿菌Methanobacterium thermoautotrophicum RecA (mini-Mtu RecA)[10]和蟾分枝桿菌Mycobacterium xenopi GryA (M. xenopi GryA)[11]。與Sce VMA內含肽不同的是，這些內含肽在N端斷裂反應被阻止(mini-Mtu RecA的C1A突變；Mxe GryA的-1位氨基酸突變)的條件下，可以通過調節(jié)pH和溫度控制C端斷裂反應的進行。在Wood等的研究中，將Mtu RecA內含肽改造成只有18 kDa的C端斷裂型內含肽。而且C端斷裂反應通過調節(jié)pH和溫度控制斷裂反應的進行，從而避免了還原劑DTT的使用。37 ℃時，12 h達到97%以上的斷裂效率[10]。此外，NEB公司還研究了1種天然的微小型連續(xù)內含肽集胞藻屬Synechocystis sp. PCC 6903 DnaB (Ssp DnaB)。這種內含肽的斷裂效率和斷裂條件與mini-Mtu RecA相似。利用這種內含肽，NEB公司又推出了IMPACTTM-TWIN蛋白表達純化體系。

雖然對多種連續(xù)型內含肽進行了一系列的改造及在親和純化方面的應用研究，但在蛋白表達和前體蛋白純化過程中內含肽提前斷裂的問題依然無法解決。因此，為了解決提前斷裂的問題，有研究將連續(xù)型內含肽人工斷裂為兩部分并分別表達。分別表達的兩片段可以相互識別結合并完成剪接反應，而且其反應速率并未受到影響[12-13]。

2.2 近期——斷裂內含肽時期

雖然斷裂內含肽在1998年就被發(fā)現(xiàn)，但其應用于蛋白的純化卻是從2011年才開始的。Jian等將人工斷裂內含肽Ssp DnaB的IN和IC分別與親和標簽和目標蛋白相連，并分別表達。通過親和標簽將內含肽的一端片段(IN或IC)與層析介質親和結合，再利用IN與IC之間的親和識別結合能力固定前體蛋白，然后通過誘導斷裂將目標蛋白純化出來[14]。此外，根據(jù)內含肽的結構將Ssp DnaB從不同位置處斷開，還構建了S1型和S11型Ssp DnaB斷裂內含肽。

除了人工斷裂內含肽，天然斷裂內含肽在蛋白純化系統(tǒng)中的應用也是近幾年剛剛開始的。其中研究最多的是點形念珠藻屬Nostoc punctiforme DnaE (Npu DnaE)內含肽。Npu DnaE內含肽與Ssp DnaB內含肽在蛋白序列上具有較高的同源相似性而且斷裂反應速率較快，因此，針對這2種系統(tǒng)的改造也較多。除了避免提前斷裂之外，改造后的Npu DnaE內含肽的斷裂速率已有較大提高，已達到5 min內斷裂率達90%以上[15]。斷裂速率的提高也極大提高了蛋白純化系統(tǒng)的純化效率。因此，這也是一種極具前景的研究方向。

斷裂內含肽親和純化系統(tǒng)對目標蛋白純化的過程原理大致相似(圖 2)，主要包括：1)配基(斷裂內含肽的IN或IC)與介質的結合形成親和層析介質。2)平衡，前體蛋白上樣至親和層析介質中，IN與IC因親和作用而相互識別結合。3)洗滌，將不能與配基識別結合的雜蛋白除去。4)洗脫，通過改變條件誘導斷裂反應的發(fā)生，獲得不含標簽的目標蛋白。5)親和層析介質的再生，通過提高環(huán)境的pH使IN和IC失去親和作用而相互分離，還原親和層析介質。圖 2中比較了連續(xù)型內含肽純化系統(tǒng)與斷裂內含肽純化系統(tǒng)純化過程。

3 內含肽介導的純化體系研究

從純化體系的類型上來劃分，可以將內含肽介導的純化體系分為層析型和非層析型兩類。層析型親和純化系統(tǒng)在應用研究中占主要地位，而非層析型的研究相對較少。兩者的主要區(qū)別在于含有內含肽的蛋白片段是否連接到層析介質上并形成一種固相的層析體系。以下分別對這2種純化系統(tǒng)進行介紹。

3.1 層析型親和純化體系中配基與介質的結合方式

本文大部分內容都是基于層析型純化體系的討論，包括上文的純化體系發(fā)展歷程和下文中對斷裂反應控制的研究。因此，我們主要介紹層析型純化體系中配基與介質的結合方式。

對基于層析介質的親和純化體系，配基與介質的結合強度決定著親和介質可以重復使用的次數(shù)。對斷裂內含肽介導的親和純化體系，我們可以將親和標簽和與其相連的IN或IC片段作為整體并視為一種親和配基。將一段多肽鏈與介質結合，其結合方式不同結合的強度也不同，從而影響了配基在介質上的穩(wěn)定性。因此，在討論內含肽斷裂反應的控制之前，配基與介質的偶聯(lián)方式也是一個重要的問題。

多數(shù)研究中采用CBD純化標簽與Chitin介質親和結合的形式，將一端連有CBD標簽的斷裂內含肽配基與介質結合[14, 16-17]。這種方法的成本較低，但由于結合的穩(wěn)定性和特異性較低，配基很容易從介質上脫落，造成目標蛋白污染，同時也降低了介質重復使用次數(shù)。Chen等使用此方法證明，親和層析介質的有效純化次數(shù)在4次左右[17]。此外，可以使用特異性和穩(wěn)定性較好的His標簽與Ni的親和結合，但這一層析介質會受到還原劑、二價金屬離子等多種條件的影響。在斷裂內含肽相互結合發(fā)生斷裂反應的過程中這些因素無法避免，也就阻礙這種方法的應用。

在最近的研究中，有采用共價偶聯(lián)的方式將配基連到介質上。這種方法在內含肽的末端添加1個Cys，利用Cys的巰基對介質上的活化基團進行親核攻擊，形成共價連接。這種方法制備的親和層析介質的配基較穩(wěn)定，但其偶聯(lián)后的配基與內含肽的另一端的結合能力以及斷裂反應速率都有可能降低。

3.2 內含肽介導的非層析介質親和純化系統(tǒng)

非層析的親和純化系統(tǒng)借助一種非層析蛋白純化標簽，它與內含肽的IN或IC一起作為控制蛋白的分子開關，通過條件控制達到純化目標蛋白的目的。

ELP (Elastin like polypeptide)標簽是應用最多的1種非層析蛋白純化標簽。它是一段含有VPGXG (X為除Pro之外的任何氨基酸)多重復肽鏈，且其是1種溫度敏感型蛋白。當溫度高于一定的閾值時會發(fā)生聚集反應，而當溫度低于這個閾值其又會重新溶解。含有ELP標簽的融合蛋白也可以簡單地通過幾步溫度轉變純化得到。因此，目標蛋白與IN或IC的融合蛋白可以借助于非層析標簽純化得到，再通過蛋白質內含子的自我斷裂將目的蛋白從融合蛋白中釋放[18]。

施長華等將Mtu RecA斷裂成N端和C端2個片段并分別與ELP標簽融合，目標蛋白融合于C端片段末端。在此模型中，含有目的蛋白和ELP標簽的C端融合蛋白為前體蛋白，而蛋白質內含子的N端與ELP標簽融合蛋白則是1個分子開關蛋白[19]。ELP純化標簽可以使2個蛋白片段通過改變溫度的手段在體外條件下分別純化得到。然后，在體外添加N端分子開關蛋白則可激活蛋白質內含子的C端斷裂活性并最終端釋放目的蛋白。

另外，施長華等還構建了一種利用小肽控制的基于S1型斷裂內含肽的非層析蛋白親和純化系統(tǒng)[20]。此系統(tǒng)將小肽控制的斷裂內含肽系統(tǒng)和非層析標簽ELP的功能相結合，含有缺失N端11個氨基酸的內含肽與ELP的融合蛋白在體內沒有斷裂活性，表達過程中前體蛋白得到了很好的保留。表達通過ELP標簽可純化得到前體蛋白，然后通過添加N端11個氨基酸的小肽誘導內含肽發(fā)生C端斷裂并得到目的蛋白。

這種不基于層析介質的純化方法可以避免層析介質與配基蛋白片段結合的不穩(wěn)定而造成的蛋白脫落。同時，IN與IC在體外條件下的結合作用更強，可以減少目標蛋白中出現(xiàn)的未斷裂的前體蛋白。這種新型的純化手段為解決內含肽提前斷裂的問題提供了一種新思路。

4 對內含肽斷裂反應的控制

迄今為止，已經(jīng)有多種內含肽應用于構建親和純化系統(tǒng)。不同內含肽的斷裂反應速率和條件會導致純化效率不同。因此，本文對應用于親和純化系統(tǒng)的內含肽斷裂反應特性進行了比較(表 1)。早期發(fā)現(xiàn)的內含肽一般C端斷裂反應速率較慢、反應時間長，而N端斷裂又需要高濃度的硫醇還原劑[22]。而且，對于連續(xù)型內含肽，其表達過程中的提前斷裂無法避免。因此，提高連續(xù)型內含肽的斷裂反應速率、阻止提前斷裂是研究的關鍵。最近的一些研究采用了將一段連續(xù)的內含肽人為分為兩部分，雖然這種方法在抑制提前斷裂方面有作用，但分開后的兩片段親和力較差[23]。而自然斷裂內含肽的發(fā)現(xiàn)解決了內含肽在體外重組效率較低的問題，對內含肽親和純化領域的應用產(chǎn)生了重要的影響，但同時也存在斷裂速率不可控制的問題。針對以上內含肽在應用中存在的問題，以下將具體討論內含肽應用于親和純化時對內含肽斷裂反應進行的改造研究。

4.1 內含肽序列的改造

用于構建商品化IMPACT-TWIN的內含肽Mxe GyrA是一種應用于連續(xù)型內含肽。這種純化體系中內含肽的提前斷裂問題是影響蛋白產(chǎn)量的關鍵。由于斷裂反應需要內含肽首位氨基酸為帶有自由巰基的Cys，因此，有研究通過突變內含肽內部的2個氨基酸為Cys，使其與首位氨基酸Cys之間形成二硫鍵，從而抑制斷裂反應提前進行[24]。

鑒于天然斷裂內含肽的斷裂位置，很多連續(xù)型內含肽被改造成斷裂內含肽(斷裂位點為歸巢核酸內切酶區(qū)域，稱為S0型)。人工斷裂內含肽的應用以Ssp DnaB最為典型。Ssp DnaB是由12個β-sheet組成的馬蹄形結構，在此基礎上，靠近剪接活性區(qū)域兩端的新型斷裂內含肽在近幾年也被成功構建。如前11位氨基酸發(fā)生斷裂的S1型斷裂內含肽(第2個與第3個β-sheet之間發(fā)生斷裂)[25]，以及在微小內含肽末6位斷裂的S11型斷裂內含肽(第11和12個β-sheet之間發(fā)生斷裂)[26]。這些基于Ssp DnaB的斷裂內含肽的斷裂速率與連續(xù)型內含肽相當，25 ℃、16 h斷裂率約為90%。另外，Ssp DnaB S1型斷裂內含肽可以將N端11個氨基酸的小肽在體外合成，并添加到C端片段的前體蛋白中誘導斷裂。但這種方法的成本較高。

另一種斷裂內含肽純化系統(tǒng)是以Npu DnaE為基礎構建的。與Ssp DnaB不同的是，如果Npu DnaE的N端斷裂反應被阻止那么C端斷裂反應也無法進行[16, 27]。Chen等根據(jù)同源性相近的內含肽Npu DnaE與mini-Mtu RecA之間的序列比對和分子建模，確定Npu DnaE的Asp118是阻止C端斷裂反應的關鍵因素[15]。將Npu DnaE的Asp118突變?yōu)镚ly后，便解除了N端突變后對C端斷裂反應的抑制。經(jīng)改造后的Npu DnaE內含肽的C端斷裂反應速率較快，在室溫、DTT的條件下，3 h斷裂反應完成80%。

4.2 空間位阻對斷裂反應的作用

對斷裂型內含肽來說，IN和IC兩端連接肽鏈的大小對斷裂反應速率也有影響。根據(jù)對Npu DnaE內含肽IN和IC相互識別結合作用方式的分析，如果多肽鏈分別位于IN和IC的兩端(即N端和C端)，此時空間位阻最大，斷裂反應速率就會下降(圖 3)。Chen等將位于INN端的親和標簽移動到C端，這樣就降低了IN和IC親和結合時的空間位阻，使斷裂反應速率大大提高——在室溫、DTT的條件下，30 min就可以完成全部的斷裂反應[17]。

目前，內含肽空間位阻對斷裂反應速率的影響只在NpuDnaE內含肽的基礎上嘗試應用過。按照其相互作用方式推測，這種思路也應同樣適用于其他種類的內含肽中。

4.3 Zn2+對斷裂反應的抑制

如果內含肽兩片段識別結合后的斷裂反應速率很快并且不可控制，會導致在層析純化中前體蛋白與配基結合后就會發(fā)生斷裂，目標蛋白隨雜蛋白被洗下，從而會導致純化效率降低。因此，在提高內含肽斷裂反應速率的同時需要確定可控斷裂的反應條件。

在蛋白質內含肽的結構晶體解析過程中發(fā)現(xiàn)，蛋白質內含肽PI-SceI的C端剪接區(qū)域存在一個Zn2+結合區(qū)域[27]。隨后Paulus等證明Zn2+可以抑制內含肽Mtu RecA和Ssp DnaE的剪接反應，并且在較低的濃度下就可達到完全抑制內含肽的剪接反應。Evans等進一步研究了Zn2+對Ssp DnaE的剪接與斷裂反應的影響[28]。盡管在多種內含肽的結構中都發(fā)現(xiàn)了Zn2+結合區(qū)域，但這些結合區(qū)域卻不完全一樣。例如在Ssp DnaE中Zn2+的結合區(qū)域是由His48、Asp140、His110以及+1 Cys組成[29]，而Mtu RecA中Zn2+的結合區(qū)域則是由His429、Glu424、Asn440以及相鄰分子的His439組成[30]。此外，Zn2+對內含肽剪接反應的抑制主要是通過影響蛋白質剪接過程中的電荷傳遞，從而最終使剪接反應無法順利進行[31]。雖然內含肽與Zn2+的結合非常牢固，但這種結合力卻不如金屬螯合劑(例如EDTA)與Zn2+的結合能力強，因此可通過金屬螯合劑將Zn2+從內含肽中去除以恢復剪接反應[32]。此外，除Zn2+外的其他二價金屬離子也有抑制內含肽斷裂反應的作用，例如Cu2+、Ni2+、Mg2+等，但它們的抑制效率低于Zn2+[33]。

雖然Zn2+對內含肽Mtu RecA和Ssp DnaE的剪接反應有抑制效果，但實驗表明，對于改造后的斷裂內含肽Npu DnaE體系Zn2+的抑制效果并不明顯。而且，Zn2+濃度過高(大于2.5 mmol/L)很容易導致蛋白沉淀。因此，對于斷裂內含肽在親和純化系統(tǒng)的應用方面，Zn2+對不同內含肽斷裂反應的控制還需要更多的研究。

5 結論與展望

應用于親和純化系統(tǒng)的內含肽已從起初的連續(xù)型內含肽發(fā)展為改造的斷裂內含肽，從需要其他親和純化手段的輔助到形成獨立的系統(tǒng)。從其發(fā)展的方向來看，斷裂內含肽介導的快速且具有自發(fā)除去親和標簽功能的親和純化系統(tǒng)的應用前景最為廣闊；同時，這種新型親和純化系統(tǒng)的構建需要對斷裂內含肽的反應進行控制。當前對于內含肽斷裂反應控制方面的研究還遠遠不足。如果能夠找到一種在一定誘導條件下能快速發(fā)生斷裂，并且在一定控制條件下能完全抑制斷裂的內含肽及其控制手段，那么將對內含肽在親和純化系統(tǒng)中的應用帶來極大的進步；將非層析標簽與斷裂內含肽系統(tǒng)相結合構建的非層析內含肽親和純化系統(tǒng)的研究雖然不多，但這種新型的純化手段為解決內含肽提前斷裂的問題提供了一種新思路，也具有廣闊的應用前景。

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