摘要: 本文擬構(gòu)建一種模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基因活化支架 (ECM-m-GAM), 并對其結(jié)構(gòu)、機(jī)械強(qiáng)度和釋放性能進(jìn)行表征。首先制備細(xì)胞穿膜肽 TAT 修飾的脂質(zhì)體基因載體 TAT-LPD, 然后將 TAT-LPD 與 RGD 修飾的透明質(zhì)酸混合, 加入交聯(lián)劑 MMPs 敏感肽 (HS-MMP-SH), 使透明質(zhì)酸凝膠化, 在凝膠化過程中實(shí)現(xiàn)對TAT-LPD 的負(fù)載, 從而將細(xì)胞黏附因子 RGD、MMPs 敏感底物和高效的基因轉(zhuǎn)染載體 TAT-LPD 有機(jī)地整合到 一個結(jié)構(gòu)中, 完成 ECM-m-GAM 的構(gòu)建。利用 PicoGreen 試劑盒考察 ECM-m-GAM 在不同釋放介質(zhì)中 DNA 的釋放行為。研究結(jié)果表明: TAT-LPD 在透射電鏡下呈球形, 平均粒徑為 (263.0 ± 4.30) nm, 可被成功地包埋在ECM-m-GAM 中; ECM-m-GAM 具有典型的凝膠結(jié)構(gòu), 機(jī)械強(qiáng)度隨著透明質(zhì)酸用量的增加而增強(qiáng), 透明質(zhì)酸用量為 4%時其彈性模量約為 1 600 Pa, 適合支架植入和組織修復(fù); DNA 從 ECM-m-GAM 中的釋放呈現(xiàn)明顯的 MMPs敏感性, 并且釋放的 DNA 仍以納米粒的形式存在, 能夠轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs) 并表達(dá)綠色熒光, 為后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和組織修復(fù)研究奠定了基礎(chǔ)。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展, 利用組織工程技術(shù)進(jìn)行缺損組織和器官的修復(fù)與再生已成為一種極具潛力的治療手段, 生長因子是組織工程中應(yīng)用的重要的細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì), 具有誘導(dǎo)和刺激細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞存活等多方面的生物功能。然而, 生長因子多為蛋白類藥物, 其半衰期比較短, 在體內(nèi)容易失去生物活性, 只能在短期內(nèi)產(chǎn)生效果, 此外, 生長因子的價格昂貴, 治療成本高。
近年來, 基因治療技術(shù)的發(fā)展及其在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用為這些問題的解決提供了新的策略。將編碼有生長因子并具有轉(zhuǎn)染能力的 DNA 融合于生物可降解材料中構(gòu)建含 DNA 的生物支架, 即基因活化支架 (gene-activated matrix, GAM)[1]。將 GAM 直接植入到組織缺損區(qū), 可在植入部位釋放 DNA 并轉(zhuǎn)染附近的細(xì)胞。一旦轉(zhuǎn)染成功, 細(xì)胞將成為生物反應(yīng)器, 持續(xù)表達(dá)并分泌基因所編碼的生長因子, 達(dá)到對細(xì)胞分化和組織再生調(diào)控的目的[2, 3]。GAM 在結(jié)構(gòu)上包含 DNA 復(fù)合物和支架材料兩部分, 這兩部分的功能決定了 GAM 的功能。目前, 關(guān)于 GAM 的研究熱點(diǎn)主要集中于仿生支架的設(shè)計及如何實(shí)現(xiàn)高效的 DNA轉(zhuǎn)染這兩個方面。

細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix, ECM) 是體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境, 是由纖維蛋白和多糖組成的復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu), 它通過黏附因子與細(xì)胞表面受體結(jié)合, 促使細(xì)胞在基質(zhì)上附著, 細(xì)胞則通過自身釋放的酶降解基質(zhì), 為自身的遷移和增殖創(chuàng)造空間, ECM 對維持細(xì)胞的生理活動具有重要的作用。支架作為承 載細(xì)胞附著、生長和增殖的微環(huán)境, 應(yīng)最大程度地模擬 ECM 的功能。凝膠是組織工程中常用的支架形式, 其交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的多孔結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞的遷移及活性物質(zhì)的傳遞, 可以很好地模擬 ECM 的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)?；|(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMPs) 屬于細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶家族。在組織修復(fù)過程中, 細(xì)胞能夠分泌 MMPs, 它幾乎能降解 ECM 中的各種蛋白成分, 從而為細(xì)胞的遷移與增殖提供空間。RGD 肽是一類含有精氨酸−甘氨酸−天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp) 的短肽, 存在于多種生物細(xì)胞外基質(zhì)中, 能特異性識別細(xì)胞表面的整合素并與之結(jié)合, 是細(xì)胞在 ECM 中附著和遷移的識別部位。受此啟發(fā), Lutolf 等[4]用 MMPs敏感肽交聯(lián)聚乙二醇 (PEG) 制備 PEG 凝膠, 再將RGD 連接到凝膠上構(gòu)建細(xì)胞支架。該凝膠支架兼具細(xì)胞黏附因子 RGD 及 MMPs 敏感性。依靠 RGD 介導(dǎo)及 MMPs 的酶解作用, 人纖維母細(xì)胞能夠吸附并侵入凝膠內(nèi)部, 體內(nèi)研究表明負(fù)載骨形成蛋白 BMP-2 的凝膠支架具有良好的骨修復(fù)作用。Kim 等[5]將 RGD修飾的透明質(zhì)酸用 MMPs 敏感肽交聯(lián)制備凝膠支架, 更好地仿生了ECM的功能, 因為透明質(zhì)酸是ECM中的主要成分, 它存在于遷移細(xì)胞的周圍, 能夠抑制細(xì)胞間的黏附, 促進(jìn)細(xì)胞遷移。Lei 等[6]考察了小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在上述凝膠支架中的生長情況, 結(jié)果表明 MMPs 敏感性及 RGD 的存在有利于細(xì)胞在支架中的遷移、生長和增殖。

細(xì)胞穿膜肽 TAT (transcriptional activator protein) 具有高效的入胞能力, 能夠迅速破壞內(nèi)吞體膜, 逃 逸溶酶體。TAT 已經(jīng)成功攜帶多種生物活性物質(zhì)及 載體, 包括蛋白質(zhì)、DNA、多肽、納米粒和脂質(zhì)體等進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)傳輸, 是一種新型而高效的藥物遞送工具[7, 8]。利用 TAT 修飾非病毒載體可以實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)染。Torchilin 等[9]用 TAT 修飾負(fù)載 DNA 的脂質(zhì)體, 構(gòu)建 TAT-liposome-DNA 復(fù)合物, 其對鼠 NIH/3T3成纖維母細(xì)胞和 H9C2 心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率顯著高于未經(jīng) TAT 修飾的 DNA 脂質(zhì)體。

本文率先提出構(gòu)建一種新型的“細(xì)胞外基質(zhì)仿生型基因活化支架”(ECM-mimicking-GAM, ECMm-GAM): 用 TAT 修飾脂質(zhì)體作為高效的基因轉(zhuǎn)染載體, 將其與 RGD 修飾的透明質(zhì)酸混合, 加入交聯(lián)劑MMPs 敏感肽 (HS-MMP-SH) 使透明質(zhì)酸凝膠化, 得到脂質(zhì)體/凝膠復(fù)合系統(tǒng)。從而將具有高效轉(zhuǎn)染能力的 TAT 脂質(zhì)體、細(xì)胞黏附因子 RGD 和對細(xì)胞分泌酶 MMPs 敏感的交聯(lián)鏈整合到同一個結(jié)構(gòu) (透明質(zhì)酸凝膠) 中, 完成 ECM-m-GAM 的構(gòu)建。本文將優(yōu)化并報道該支架的制備方法, 表征其表面形態(tài)和機(jī)械性能, 評價其對 DNA 復(fù)合物的負(fù)載及 MMPs 敏感性釋放行為, 為細(xì)胞轉(zhuǎn)染及組織修復(fù)研究奠定基礎(chǔ)。