摘要:

生物大分子在許多疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用, 但由于細(xì)胞膜的天然屏障作用, 只有分子質(zhì)量小于600 Da 的分子才能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這使得一些有治療價(jià)值但無細(xì)胞膜穿透性的分子在細(xì)胞生物學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用受到極大的限制。近年來發(fā)現(xiàn)的一些具有細(xì)胞穿透功能的短肽 (少于 30 個(gè)氨基酸) 即細(xì)胞穿膜肽 (CPPs), 能夠有效地將蛋白質(zhì)、多肽、核酸片段等以多種方式導(dǎo)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞, 其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且不會(huì)造成細(xì)胞損傷。CPPs 的發(fā)現(xiàn)為生物大分子在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評(píng)價(jià)以及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域等均具有良好的應(yīng)用前景。本文就 CPPs 的種類特點(diǎn)、內(nèi)化機(jī)制、應(yīng)用及其存在的問題進(jìn)行討論和評(píng)述.

絕大多數(shù)疾病都需要在分子水平進(jìn)行診斷治療。而人們面臨的一個(gè)主要問題是真核細(xì)胞和細(xì)胞器, 以及細(xì)胞壁和致病性微生物的膜, 使得許多具有很好的體外生物活性大分子包括藥物不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi), 以至于無法發(fā)揮其應(yīng)有的作用。為克服這些生物活性大分子在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的障礙, 人們已經(jīng)發(fā)展了各種技術(shù)。運(yùn)輸遺傳物質(zhì)一般使用病毒載體, 但對(duì)于有些遺傳病這種方法似乎不可行。非病毒的方法, 像電穿孔、顯微注射及使用脂質(zhì)體, 在常規(guī)和基因藥物運(yùn)輸中得到了發(fā)展, 但顯微注射法或電穿孔法對(duì)細(xì)胞具有創(chuàng)傷性, 可能損傷甚至破壞細(xì)胞膜, 屬于侵襲性的方法。而非侵襲性的方法包括 pH 值敏感的脂質(zhì)體, 要求在低酸環(huán)境下使膜失去穩(wěn)定性從而釋放藥物進(jìn)入胞漿, 對(duì)于人體生理環(huán)境中藥物作用的研究具有一定局限性。

 在過去的幾十年里, 人們發(fā)現(xiàn)了一些肽和蛋白質(zhì)能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi), 而且多種運(yùn)載物分子也可以與這些肽和蛋白質(zhì)連接并易位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這些肽和蛋白質(zhì)載體構(gòu)成一種新的很有潛力的藥物運(yùn)輸載體,即細(xì)胞穿膜肽 (cell-penetrating peptides, CPPs), 它是一大類由 10～30 個(gè)氨基酸組成的短肽, 也稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域 (protein translocation domain, PTD) 或“特洛伊木馬”肽 (Trojan horse peptides) 或轉(zhuǎn)導(dǎo)肽 (transduction peptide) 等。這些肽分子不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞膜永久性損傷, 并且毒性低。本文對(duì)于 CPPs的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、穿膜機(jī)制、應(yīng)用前景及可能存在的問題等方面進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞穿膜肽的性質(zhì)、分類及結(jié)構(gòu)特征

到目前為止,已發(fā)現(xiàn)了多種 CPPs, 它們共有的性質(zhì)[1]: ① 具有凈正電荷性和兩親性; ② 穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)效高; ③ 可以導(dǎo)入近乎所有的細(xì)胞; ④ 可以攜帶多種活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞; ⑤ 可以通過固相合成或原核表達(dá)制備, 方法成熟簡(jiǎn)便。CPPs 的分類以及統(tǒng)一的術(shù)語還沒有。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn), 得到不同的種類。最近有學(xué)者根據(jù)短肽的特點(diǎn)和來源將其分為 3 大類: ① 蛋白衍生肽(protein derived CPPs), 如 penetratin、TAT 和 pVEC等; ② 模型肽(model peptides) 如MAP和 (Arg) 7等; ③ 設(shè)計(jì)肽 (designed CPPs) 如 MPG 和Transportan等[2]。從其兩親性性質(zhì)[3]也可將其分為 3 類: ① 兩親性 CPPs (PaCPPs), 如 MPG、transportan、TP10、Pep-1; ② 中等兩親性 CPPs (SaCPPs), 如 penetratin, RL16; ③ 非兩親性 CPPs (NaCPPs), 如 R9。

2 細(xì)胞穿膜肽的跨膜過程及其機(jī)制

有關(guān) CPPs 的內(nèi)化機(jī)制一直以來存在爭(zhēng)議。不論通過何種機(jī)制穿膜, 理論上 CPPs 首先接近細(xì)胞膜的脂質(zhì)層[4], 與其發(fā)生作用后進(jìn)入細(xì)胞。

2.1 結(jié)合模式   目前認(rèn)為 CPPs 與細(xì)胞膜的結(jié)合模式有兩種[5], 多位點(diǎn)結(jié)合模式和靜電吸引模式。多位點(diǎn)結(jié)合模式, 帶正電荷的 CPPs 可能與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的葡糖胺聚糖結(jié)合, 也有可能與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的脂質(zhì)結(jié)合。CPPs 中存在的帶正電荷的堿性氨基酸與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合是 CPPs 穿膜的必要條件。靜電吸引模式, 即通過疏水性吸附作用, 靠近膜表面的肽段發(fā)生非特異性的靜電積聚。Ziegler 等[3]根據(jù) CPPs 的兩親性程度分別闡述了其與膜的結(jié)合機(jī)制以及其在膜上的定位。PaCPPs 與膜結(jié)合時(shí)主要靠疏水作用插入膜內(nèi), 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(α 螺旋或 β 折疊結(jié)構(gòu)的形成), 且不耗能。SaCPPs 在與膜結(jié)合時(shí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 通過靜電作用輕微插入脂質(zhì)雙分子層。相反, NaCPPs 與膜結(jié)合時(shí)僅僅輕微吸附于膜上, 不會(huì)插入到脂質(zhì)分子層中。PaCPPs 與SaCPPs 在穿膜時(shí)都會(huì)使脂質(zhì)層發(fā)生紊亂, 形成跨膜靜電域,一些 CPPs 自組裝會(huì)進(jìn)一步擾亂脂質(zhì)雙分子層的完整性。而在低摩爾濃度、低陰離子脂質(zhì)組分膜條件下, SaCPPs、NaCPPs 與膜之間不會(huì)發(fā)生相互作用。關(guān)于易位過程中肽與膜之間作用后形成的結(jié)構(gòu), 人們也提出了很多種模型[6]: 反相膠束模型, 局部電穿孔, 暫時(shí)的孔結(jié)構(gòu)[7, 8], 誘導(dǎo)膜融合, 內(nèi)吞通道[9]或幾種模型的結(jié)合。

2.2 內(nèi)化機(jī)制   關(guān)于 CPPs 的內(nèi)化機(jī)制 (穿膜機(jī)制/易位機(jī)制/轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制) 一般可分為兩種[10, 11]: 轉(zhuǎn)導(dǎo)(易位) 模式, 包括直接穿膜和跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)模式, 跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)模式 (translocation models)[12]又包括反轉(zhuǎn)微團(tuán)(inverse micells)、地毯 (carpet) 及打孔 (barrel stave) 模型 (圖 1); 內(nèi)吞模式 (endocytosis), 包括網(wǎng)格蛋白(clathrin, 120 nm)、脂質(zhì)筏/小窩蛋白(caveolin, 50～80 nm)[13, 14]和巨胞飲 (macropinocytosis, 1～5 μm) 介導(dǎo)的模式 (圖 2)。轉(zhuǎn)導(dǎo)模式與內(nèi)吞模式的主要不同在于轉(zhuǎn)導(dǎo)的 CPPs 在穿膜后直接定位于細(xì)胞質(zhì), 而內(nèi)吞的CPPs 被限制在囊泡中。一般來說, 當(dāng) CPPs 運(yùn)載小的親水性藥物時(shí), 多肽誘導(dǎo)膜紊亂使肽直接易位進(jìn)入胞內(nèi); 而當(dāng)運(yùn)載大的親水性藥物時(shí)膜紊亂程度較低, 內(nèi)吞作用似乎是比較合適的易位機(jī)制[11]。

巨胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[15]是最近提出的一種CPPs 運(yùn)載大分子藥物 (MW > 30 000 Da) 的入胞機(jī)制, 它是一種非網(wǎng)格蛋白、非脂質(zhì)筏介導(dǎo)的依賴肌動(dòng)蛋白的一種非特異性內(nèi)吞過程。最近的研究重點(diǎn)是巨胞飲作用并認(rèn)為其是細(xì)胞內(nèi)化的主要途徑, 它能在不同程度上發(fā)生于所有的細(xì)胞內(nèi), 而且可以從膜的邊緣擾動(dòng)和形成囊泡的大小兩個(gè)方面區(qū)分巨胞飲與其他形式的內(nèi)吞作用。

 最近, 人們又提出了一種有關(guān)富含胍鹽基團(tuán)的CPPs 的單獨(dú)運(yùn)輸或其與小分子 (MW < 3 000 Da) 結(jié)合的運(yùn)輸機(jī)制。CPPs 的胍鹽基團(tuán)可以與細(xì)胞表面的負(fù)電性基團(tuán)形成二齒狀的氫鍵, 產(chǎn)生的離子對(duì)在膜電位的作用下易位穿過細(xì)胞膜, 離子對(duì)在膜內(nèi)部分離, 釋放出 CPPs 到細(xì)胞質(zhì)中。也有可能是不同平衡離子 (兩親性的或親水性的) 的存在將導(dǎo)致 CPPs 的電荷中和或電荷重置, 這類 CPPs 在物理性質(zhì)上的動(dòng)力學(xué)因素的改變將促使其分配進(jìn)入脂質(zhì)雙分子層中(穿膜過程)。也有研究[16]認(rèn)為陽離子穿膜肽與磷脂離子配對(duì)克服了穿膜過程中存在的固有能壘, 以一種非內(nèi)吞作用的形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。不過, 研究證明, 一些外源兩親性平衡離子, 如十二烷基硫酸鈉或磷脂酰甘油/無機(jī)磷酸鹽在非生理?xiàng)l件下加入能夠促進(jìn)CPPs 的體內(nèi)內(nèi)化。

CPPs 介導(dǎo)的無論小分子還是大分子的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制有多種。一般來說, CPPs 或 CPP 與小分子的結(jié)合物內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞是通過靜電作用和形成氫鍵的易位或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用; 而 CPP 與大分子的結(jié)合物是通過能量依賴的內(nèi)吞作用, 特別是巨胞飲作用內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞[17]。含有胍鹽基團(tuán)的 CPPs 可能以一種平衡離子介導(dǎo)的特殊穿膜機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。然而, 在這幾種情況下, CPPs 與細(xì)胞表面的陰性殘基的直接接觸是成功穿膜的必要條件。

CPPs 與藥物分子或基因或顆粒結(jié)合內(nèi)化后的歷程與藥物分子、基因或顆粒本身的性質(zhì)、CPPs 的性質(zhì)及所選用的細(xì)胞體系密切相關(guān)。CPPs 或 CPPs-藥物分子可能的內(nèi)化歷程[10]如圖 3 所示。如果 CPPs 或CPPs-藥物分子直接易位進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中, 可能會(huì)與細(xì)胞質(zhì)中的一些靶向物相互作用, 使 CPPs 或 CPPs-藥物分子被運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)、被細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶降解或很可能以完整分子或降解后的分子形式轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外; 如果 CPPs 或 CPPs-藥物分子是以內(nèi)吞作用機(jī)制內(nèi)化, 其歷程取決于內(nèi)吞機(jī)制的類型, CPPs 或 CPPs-藥物分子很可能經(jīng)過溶酶體降解、可能在降解前從胞內(nèi)體(內(nèi)涵體) 中逃逸出來隨后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中, 有可能進(jìn)入核內(nèi), 到達(dá)高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中或胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。

2.3 不同性質(zhì)的 CPPs 的內(nèi)化機(jī)制 不同性質(zhì)的CPPs 會(huì)有不同的內(nèi)化通道[3]。在低摩爾濃度和低陰離子脂質(zhì)組分膜條件下, 只有 PaCPPs 在通過脂質(zhì)雙分子層時(shí)呈現(xiàn)出直接易位作用, 且它們的直接易位作用在大分子藥物[18]和熒光基團(tuán)的存在下減少。相反, SaCPPs 的直接易位作用要求在較高的肽濃度(>100 μmol·L−1) 和較高的陰離子脂質(zhì)組分膜的條件下才能發(fā)生。NaCPPs 則要求更高的肽濃度 (>1 mmol·L−1) 和陰離子脂質(zhì)組分膜 (70%) 才能夠擾亂膜發(fā)生直接易位作用。即在低摩爾濃度下, 內(nèi)吞作用具有優(yōu)勢(shì), 而直接易位作用在高濃度下才可能發(fā)生。

2.4 影響 CPPs 內(nèi)化機(jī)制的因素 在評(píng)估細(xì)胞穿膜肽的內(nèi)化有效性過程中存在不一致現(xiàn)象的原因是由于在比較時(shí)忽略了所用載體、藥物分子、濃度和細(xì)胞類型, 藥物分子的物理化學(xué)性質(zhì), 如親水性和所帶電荷可能會(huì)影響內(nèi)化作用, 特別是非內(nèi)吞作用的內(nèi)化機(jī)制[19]。Patel 等[10]也提出在衡量 CPPs 內(nèi)化作用時(shí)存在多方面的挑戰(zhàn)。因此, 非常有必要找出影響 CPPs內(nèi)化機(jī)制的因素。

肽分子的性質(zhì)與細(xì)胞膜的組成部分何者是主要的影響因素, 跨膜電位與肽/細(xì)胞比率何者更重要[20]?目前的研究表明, 肽與細(xì)胞表面蛋白聚糖之間相互作用和跨膜電位的存在都至關(guān)重要[12]。研究[21]發(fā)現(xiàn), CPPs 與藥物的結(jié)合降低了內(nèi)化的有效性, 并極大地改變了 CPPs 的細(xì)胞內(nèi)分布。也有研究認(rèn)為小分子的藥物不影響內(nèi)化的效率, 但大分子藥物, 內(nèi)化效率明顯降低[2]。還有學(xué)者認(rèn)為, 不同的穿膜肽在攜帶不同分子時(shí)采取的進(jìn)胞方式可能有差異, 同時(shí)其進(jìn)胞時(shí)間也會(huì)不同[11]。

從 CPPs 本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)來看, 肽分子的共同性質(zhì)兩親性以及凈正電荷對(duì)肽分子與膜和藥物分子之間發(fā)生相互作用非常重要[6]。肽的結(jié)構(gòu)和對(duì)肽的構(gòu)象[22]有影響的環(huán)境因素都會(huì)對(duì)內(nèi)化能力產(chǎn)生重要影響。肽結(jié)構(gòu)的多樣性, 可能與它的兩親性或它的凈正電荷一樣是細(xì)胞自內(nèi)化和其與脂質(zhì)的相互作用所必需的特性。如果肽必須溶解在不同的環(huán)境中像水和膜中, 它就必須通過調(diào)節(jié)構(gòu)象[23]來適應(yīng)外部的環(huán)境。

綜合來看, 影響 CPPs 內(nèi)化機(jī)制的因素主要有: 溫度、肽濃度、細(xì)胞周期、藥物分子大小及其理化性質(zhì)、非固定化細(xì)胞中不同的亞細(xì)胞分布類型、CPPs的理化性質(zhì) (氨基酸構(gòu)成、分子大小、分子構(gòu)象)、所用的細(xì)胞系、胞內(nèi)體中肽的降解、早期肽從胞內(nèi)體中的逃速度及所結(jié)合配體的熒光強(qiáng)度等。

3 細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用
大量研究表明, 穿膜肽具有強(qiáng)大的運(yùn)載潛能, 與其他生物大分子轉(zhuǎn)運(yùn)方式相比,穿膜肽的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用具有許多獨(dú)特之處[24]。CPPs 攜帶的物質(zhì)可以為蛋白質(zhì)(綠色熒光蛋白、RNA 酶、半乳糖苷酶等)、多肽 (100個(gè)氨基酸殘基以下[23])、DNA、化學(xué)小分子藥物、寡核苷酸 (100 bp 以下[23])、反義核酸、肽核酸、納米顆粒、熒光素、有機(jī)分子、腺病毒載體、成像物質(zhì)、脂質(zhì)體及鐵顆粒等。運(yùn)載能力[1]可以達(dá)到 120 kDa (如半乳糖苷酶)、40 nm (如鐵顆粒), 沒有明顯的證據(jù)表明運(yùn)載極限。細(xì)胞穿膜肽可以通過化學(xué)結(jié)合或基因融合等方式攜帶各種生物大分子[5]。CPPs 與藥物的連接方式有兩種: 非共價(jià)連接和共價(jià)連接。通過使用CPPs 還可以增加肽類藥物的活性, 以及進(jìn)行細(xì)胞器官的特異性運(yùn)輸[25]。近年 CPPs 的應(yīng)用進(jìn)展如下。
 

3.1 蛋白質(zhì)及多肽類藥物的運(yùn)輸 對(duì)許多疾病使用外源蛋白質(zhì)或多肽類藥物是一個(gè)非常有價(jià)值的治療方法。Wu 等[26]利用穿膜肽的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能來介導(dǎo)信號(hào)肽-綠色熒光蛋白-穿膜肽 NT4-GFP-Ant 融合蛋白通過細(xì)胞膜和血腦屏障到達(dá)靶細(xì)胞。Tat (Tat48−60) 能將細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑的細(xì)胞毒素肽模擬物 P21EAF1/CIP1運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi), 且研究[27]發(fā)現(xiàn)Tat48−60–P10 可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhang 等[28]根據(jù)一種 α 螺旋肽 CAI 的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出了一種細(xì)胞穿膜肽NYAD-1, 它比 CAI 具有更穩(wěn)定的 α 螺旋結(jié)構(gòu), 研究發(fā), NYAD-1能夠穿過細(xì)胞膜并與Gag聚蛋白共定位于質(zhì)膜上, 破壞病毒顆粒的自組裝。研究者[29]設(shè)計(jì)了一種含有穿膜肽、彈性蛋白類似多肽 ELP (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) 和一種衍生于細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑 P21 的結(jié)合多肽, 這種多肽能夠使 SKOV-3 卵巢癌細(xì)胞和HeLa 子宮癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速率減慢而抑制它們的增殖。HIV-Tat 與小泰勒蟲抗原 Tp2 結(jié)合形成重組at-Tp2 融合蛋白, 發(fā)現(xiàn)其能夠加強(qiáng)遲鈍的 CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)的興奮性[30]。
 

3.2 核酸類藥物的運(yùn)輸 核酸類藥物的細(xì)胞運(yùn)輸具有挑戰(zhàn)性。最近有關(guān)使用 CPPs 進(jìn)行核酸細(xì)胞運(yùn)輸?shù)睦虞^多。研究證明, 細(xì)胞膜穿透性寡肽——八聚精氨酸(R8) 修飾的脂質(zhì)體可以有效輸送 siRNA 進(jìn)入細(xì)胞并增強(qiáng)其生物學(xué)功能[31]。PalmApergi 等[32]研究一種細(xì)胞穿膜肽 MAP, 用這種典型的抗菌肽處理細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌空殼, 這種空殼可以載入所需的 DNA 或質(zhì)粒并將其運(yùn)輸進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi), 還可以用于預(yù)防接種。Meade 等[33]研究認(rèn)為, CPPs 為雙鏈 siRNA 進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)化去誘導(dǎo) RNAi 反應(yīng)提供了一種好方法。Veldhoen 等[34]研究發(fā)現(xiàn)一種新的載體肽 MPGα 能同時(shí)與核酸形成非共價(jià)連接的、具有高靈活性的復(fù)合物, 它可以作為運(yùn)輸 siRNA 的載體。

與轉(zhuǎn)座子結(jié)合的“睡美人”轉(zhuǎn)座酶能將特殊基因轉(zhuǎn)移進(jìn)目標(biāo)動(dòng)物體內(nèi)。這些特殊基因有助于治療多種疾病。有研究[35]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿膜肽 M918 可以完成“睡美人”轉(zhuǎn)座酶和一個(gè)外源轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒 (帶有一種抗生素基因) 在體外的細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)導(dǎo)運(yùn)輸。具有空間位阻的帶電荷中性寡核苷酸類似物, 如 肽 核 酸 (PNA) 和 磷酰 二 胺 嗎啉代寡 核 苷 酸(PMO), 在反義引物的應(yīng)用方面具有很好的生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)。然而, 寡聚核酸在細(xì)胞內(nèi)不能自由運(yùn)輸, 因此, Lebleu 等[36]研究了兩種富含精氨酸的 CPPs (R-Ahx-R)4AhxB (R= 精氨酸, Ahx = 胺己苯酸酯, B= β-丙氨酸) 和 R6Pen, 它們能夠在胞內(nèi)體溶解劑存在的情況下, 在低摩爾濃度下將 PNA 和 PMO 進(jìn)行有效的核運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn), 固相合成穿膜肽 Tat 能夠攜帶質(zhì)粒 DNA 穿過細(xì)胞膜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染, 并對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響[37]。
 

3.3 顆粒運(yùn)輸 Liu 等[38]將 Tat 分子連接到生物活性聚合物核/殼納米粒的表面形成 Tat-PEG (聚乙醇)- b-chol (膽固醇) 復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn), 其可以穿過血腦屏障 (BBB) 進(jìn)行藥物運(yùn)輸, 并可以進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)。Wei 等[39]研究發(fā)現(xiàn)使用一種異型雙功能偶聯(lián)劑硫代琥珀酰亞氨基-4-對(duì)馬來酰亞氨基苯基丁酸酯 (sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate, SSMPB) 將 HIV-1 Tat 與 MS2 (噬菌體衣殼) VLPs (病毒樣顆粒) 結(jié)合, 此顆?？梢砸种票透窝撞《?HCV) 的 5'-非翻譯區(qū) (VTR) 和內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREs) 的反義 RNA 的翻譯。Lu 等[40]研究發(fā)現(xiàn), 結(jié)核分歧桿菌膜蛋白 McelA 可以與膠態(tài)金顆粒和乳膠微球結(jié)合在 HeLa 細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化。生物納米顆粒 BNC 是一種含有乙型肝炎病毒表面抗原 L-蛋白的空心納米粒。BNC 只能運(yùn)輸基因或藥物進(jìn)入特定的人類肝細(xì)胞中, 因此 Shishido 等[41]試圖從遺傳學(xué)上通過引入CPPs 的方法改變 BNC 的特異性。結(jié)果表明, CPPs 與BNC 的結(jié)合能夠在短時(shí)間內(nèi)有效的內(nèi)化進(jìn)入各種細(xì)胞系, 而且沒有明顯的細(xì)胞毒性。
 

3.4 小分子藥物運(yùn)輸 研究表明, 富含精氨酸的細(xì)胞穿膜肽可以直接運(yùn)輸磷酸二酰胺嗎啉齊聚物進(jìn)入鼠類白細(xì)胞, 抑制其基因表達(dá)和改變前體 mRNA 的剪接[42]。Lindgren 等[43]設(shè)計(jì)了一種 CPP 與細(xì)胞抑制劑甲氨蝶呤 (MTX) 的結(jié)合物, 用于克服乳腺癌腫瘤細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤的耐受。將 2', 5'-寡腺甙酸四聚物(2-5A) 與短鏈 HIV-1Tat 肽用化學(xué)方法結(jié)合產(chǎn)生2-5A-Tat 嵌合體[44], 此嵌合體可以被細(xì)胞吸收并能在完整的細(xì)胞中活化核糖核酸酶 L, 它可能為 HIV的RNA 在體內(nèi)的靶向破壞提供了一種方法。
 

3.5 增強(qiáng)藥物的吸收及其他特殊功能 Kamei 等[45]發(fā)現(xiàn)通過使用 CPPs 可以促進(jìn)胰島素的腸內(nèi)吸收。Khafagy 等[46]研究發(fā)現(xiàn) L-型穿膜肽 penetratin 可以顯著增加胰島素的滲透性而使其穿過鼻膜, 并對(duì)鼻吸收黏膜上的細(xì)胞完整性不會(huì)引起明顯的破壞。Tunnemann 等[47]研究認(rèn)為細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的肽轉(zhuǎn)導(dǎo)作用不僅是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi) Ca2+無副作用情況下可以增加心肌功能的唯一方法, 而且是一般細(xì)胞或干細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間相互作用的調(diào)節(jié)和控制的非常有用的工具。Kloss 等[48]研究發(fā)現(xiàn), 含有 4～10 個(gè)精氨酸殘基的寡聚精氨酸, 特別是 (Arg)8 能夠抑制細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白水解系統(tǒng)。當(dāng)考慮寡聚精氨酸作為藥物的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸載體時(shí), 必須考慮其對(duì)蛋白酶的抑制活性問題。有研究報(bào)道, 成功設(shè)計(jì)的一種新的穿膜肽Pep-1-K (衍生于穿膜肽Pep-1) 具有強(qiáng)的抗菌活性, 可以作細(xì)菌選擇性抗菌肽[49]。Johansson 等[50]研究發(fā)現(xiàn)了一種含有 22 個(gè)氨基酸殘基的衍生于腫瘤抑制基因 P14ARF 的 N 端部分的肽 ARF (1-22), 它是一種具有 P14ARF 功能的類似物, 對(duì)細(xì)胞膜有穿透性, 膜破壞性低且能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以前研究認(rèn)為大多數(shù)CPPs 可以易位穿過哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜, 而不能穿過像酵母細(xì)胞的細(xì)胞膜。然而, Parenteau 等[51]對(duì) 20 種CPPs 進(jìn)行了測(cè)試, 發(fā)現(xiàn)有一種肽 Tp10 能有效的穿過裂殖酵母細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)均勻分布。由于治療分子不能穿過質(zhì)膜, 基因和藥物運(yùn)輸進(jìn)入眼部組織, 例如視網(wǎng)膜和角膜被阻礙, Johnson 等[52]研究發(fā)現(xiàn)了一種能用于眼部組織運(yùn)輸?shù)男码?POD, 能夠運(yùn)輸小分子和大分子藥物進(jìn)入神經(jīng)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞等。如果能夠通過高分辨率成像技術(shù)追蹤干細(xì)胞的分布和分化的能力, 對(duì)臨床和研究非常重要。Liu等[53]用一種典型的 CPP 承載釓顆粒, 此顆粒可以用于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的磁共振成像。熒光成像技術(shù)確定此復(fù)合物可以內(nèi)化進(jìn)入干細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi),毒性實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析表示此復(fù)合物不會(huì)影響細(xì)胞的生存和膜電勢(shì)梯度。關(guān)于 CPPs 的氨基酸序列見表 1。

4 細(xì)胞穿膜肽在應(yīng)用中存在的問題
CPPs 在治療應(yīng)用中存在的主要問題是使藥物分子到達(dá)細(xì)胞質(zhì)去誘導(dǎo)所需的生物反應(yīng), 藥物分子必須從胞內(nèi)體中逃逸出來。胞內(nèi)體的釋放是各種陽離子CPPs 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸過程中的主要限速步驟, 有報(bào)道稱可以使用胞內(nèi)體-瓦解肽、酸敏感的腙鍵或激光觸發(fā)胞內(nèi)體孔使胞內(nèi)體釋放等。Shiraishi 等[54]提出光化學(xué)內(nèi)化 (PCI) 方法, 通過使用光敏劑可以有效地釋放嵌入胞內(nèi)體中的藥物分子。但這些物質(zhì)的應(yīng)用對(duì)其他方面是否有影響目前尚不清楚。因此, 有關(guān)胞內(nèi)體的釋放還需要進(jìn)一步研究。一旦 CPPs 承載藥物分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi), 另一個(gè)面臨的問題是怎樣把藥物分子運(yùn)輸?shù)缴锘钚晕稽c(diǎn)。可以通過將肽序列與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)序列結(jié)合解決。但此法是否可行還有待探究。將穿膜肽用作臨床藥物的運(yùn)輸工具, 首先必須確認(rèn)肽本身不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成不利影響, 由于CPPs 具有高陽離子性[55], 因此人們擔(dān)心它們會(huì)和其他的陽離子多聚物如聚 L-賴氨酸或聚乙烯亞胺 (PEI) 一樣存在一定的毒性。一般來說, CPPs 在高濃度肽下才會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性, 但兩親性強(qiáng)的 PaCPPs 在低摩爾濃度下已經(jīng)具有細(xì)胞毒性[3]。在這方面已進(jìn)行了一些研究, 但大多是體外實(shí)驗(yàn)[11]。

CPPs 與治療性分子的結(jié)合物幾乎分布于身體的各個(gè)部分而不依賴于給藥的方式。基于 CPPs 缺乏細(xì)胞特異性的性質(zhì), 人們?cè)噲D通過將帶有負(fù)載的 CPPs與細(xì)胞特異識(shí)別分子相結(jié)合介導(dǎo)特異性細(xì)胞運(yùn)輸。與所設(shè)想一致, 細(xì)胞特異抗體與 CPPs 的結(jié)合確實(shí)增加了它們的細(xì)胞內(nèi)化作用。它也同時(shí)明顯地減少了抗體在體內(nèi)的選擇性。研究表明, 抗體的應(yīng)用不易滿足靶向性要求。目前, 抗體的直接靶向性所面臨的主要問題: 肽分子進(jìn)入細(xì)胞的非特異性與抗體和其靶向細(xì)胞的特異性配體的親和性之間存在一定的沖突。因此, 有研究者認(rèn)為將 CPPs 的穿膜活性暫時(shí)隱蔽起來, 直到 CPPs-抗體復(fù)合物到達(dá)靶向組織和適合的細(xì)胞周圍后再使 CPPs 釋放[56]。另有學(xué)者設(shè)想, 通過對(duì)藥物靶向組織所分泌的蛋白酶敏感的化學(xué)鍵將 CPPs 與某種藥物分子相連[57], 從而使得靶向藥物分子聚集在靶標(biāo)組織周圍。

CPPs 在藥物運(yùn)輸過程中的使用存在的另外一個(gè)弊端是其穩(wěn)定性差。CPPs 內(nèi)化后, 由于體內(nèi)含有各種蛋白酶, 它可能會(huì)酶解外源 CPPs 及其藥物分子; 體內(nèi)的環(huán)境包括 pH 值、離子濃度等都有可能改變CPPs 的某些性質(zhì)使其失去活性。因此, 必須通過尋找新的穩(wěn)定的CPPs[58]或?qū)ΜF(xiàn)有的 CPPs 進(jìn)行修飾改進(jìn)來解決這方面的問題。一些蛋白在內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后不再具有生物活性, 可以考慮在蛋白和 CPPs 之間插入一個(gè)連接分子來輔助在細(xì)胞內(nèi)釋放有活性的蛋白和藥物。此外, CPPs 是否有免疫原性或半免疫原性及長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生何種影響, 需要將 CPPs 序列進(jìn)一步的優(yōu)化以提高其適用性[59]。一些證據(jù)顯示, CPPs可以與任意的分子結(jié)合, 非靶向性進(jìn)入細(xì)胞內(nèi), 導(dǎo)致生物活性藥物不必要的損失。因此, 如果不能建立可行性使用方法以促進(jìn)細(xì)胞特異性運(yùn)輸, 將限制細(xì)胞穿膜肽在機(jī)體內(nèi)運(yùn)輸藥物等方面的應(yīng)用。

目前, 在能夠有效利用 CPPs 運(yùn)輸藥物以充分發(fā)揮治療作用方面有價(jià)值的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果還鮮見報(bào)道。這種載藥方式在應(yīng)用中是否存在潛在的細(xì)胞毒性以及運(yùn)輸過程中缺乏細(xì)胞特異性等問題尚未引起足夠的的重視[60]。一些 CPPs 存在細(xì)胞內(nèi)化差, 出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)代謝性降解及一些不良的生物效應(yīng)如毒性和免疫原性等。需要進(jìn)一步開展對(duì) CPPs 的藥代動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)分布等相關(guān)研究。
5 展望
CPPs 的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來了曙光, 在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、評(píng)價(jià)及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。但在 CPPs 真正應(yīng)用于臨床前仍有一系列問題需要解決。CPPs 在體內(nèi)缺乏組織特異性和細(xì)胞類型特異性, 因此增加轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的靶向性則是將來發(fā)展的一個(gè)目標(biāo), 需要構(gòu)建靶向部分。而噬菌體展示技術(shù)篩選出來的細(xì)胞特異 CPPs 提供了一個(gè)很有前景的方法。因 CPPs在體內(nèi)的酶解性, 體內(nèi)運(yùn)輸效果的不確定性, 可能存在的神經(jīng)毒性和免疫原性等, 最近細(xì)胞穿膜非肽分子載體得到發(fā)展, 如肌醇、蔗糖、乳糖、多羥糖醇 (山梨醇) 等[61]。除了 CPPs 外, 一些含有幾個(gè)氨基酸 (從3到10個(gè)) 具有細(xì)胞特異性并且可以通過內(nèi)吞作用內(nèi)化的不同肽相繼被發(fā)現(xiàn), 這些肽稱為細(xì)胞靶向肽(CTPs)[55], 并用于各種治療分析中。CTPs 與一些給定的細(xì)胞系專有表達(dá)的受體之間的相互作用具有高特異性和很強(qiáng)的親和性。鑒于 CPPs 表現(xiàn)出的穿膜特性與 CTPs 表現(xiàn)出的高特異性和親和性。CPPs 與CTPs 的共用是否能達(dá)到希望的運(yùn)輸目的, 還需要進(jìn)一步研究。