多肽合成技術(shù)
多肽化學(xué)已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程,1902年,Emil Fischer首先開始關(guān)注多肽合成,由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的知識(shí)太少,進(jìn)展也相當(dāng)緩慢當(dāng)時(shí)合成采用了苯甲酰,乙酰保護(hù),脫去相當(dāng)困難,而且容易導(dǎo)致肽鏈斷裂。直到1932年,Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基(Z)來(lái)保護(hù)α-氨基,該保護(hù)基可以在催化氫化或氫溴酸的條件下定量脫除,多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年代,隨著越來(lái)越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn),大大推動(dòng)了有機(jī)化學(xué)家們對(duì)多肽合成方法以及保護(hù)基的研究,因此這一階段的研究成果也非常豐富,人們合成了大量的生物活性多肽,包括催產(chǎn)素(oxytocin),胰島素等,同時(shí)在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績(jī),這為后來(lái)的固相合成方法的出現(xiàn)也提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。也就是這個(gè)階段,F(xiàn)red Sanger發(fā)明了氨基酸序列測(cè)定方法,并為此獲得了1958年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。還是他后來(lái)發(fā)明了DNA序列檢測(cè)方法,并于1980年再次獲得了Nobel化學(xué)獎(jiǎng),成為到目前為止唯一獲得兩次Nobel化學(xué)獎(jiǎng)的科學(xué)家。1963年,Merrifield提出了固相多肽合成方法(SPPS),這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法,一出來(lái),就由于其合成方便,迅速,現(xiàn)在已經(jīng)成為多肽合成的首選方法,隨后的發(fā)展也證明了該方法不僅僅是一種合成方法,而且也帶來(lái)了有機(jī)合成上的一次革命,并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科,固相有機(jī)合成(SPOS)。當(dāng)然,Merrifield也因此榮獲了1984年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。也正是Merrifield,他經(jīng)過了反復(fù)的篩選,最終屏棄了芐氧羰基(Z)在固相上的使用,首先將叔丁氧羰基(BOC)用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用,其可以在酸性條件下定量的脫除,反應(yīng)也非常迅速,在30min就可以反應(yīng)完全。由于叔丁氧羰基(BOC)方法中,氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)大多基于芐基(Bzl),因此也稱為BOC-Bzl策略。同時(shí),Merrifield在20世紀(jì)60年代末發(fā)明了第一臺(tái)全自動(dòng)多肽合成儀,并首次合成生物蛋白酶,核糖核酸酶(124個(gè)氨基酸)。隨后的多肽化學(xué)研究主要集中在固相合成樹脂,多肽縮合試劑,氨基酸保護(hù)基的研究。1972,Lou Carpino 首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保護(hù)α-氨基,其在堿性條件下可以迅速脫除,10min就可以反應(yīng)完全,而且由于其反應(yīng)條件溫和,迅速得到廣泛使用,到了20世紀(jì)80年代取代了叔丁氧羰基(BOC),成為了固相多肽合成中的首選合成方法。該方法中氨基酸的側(cè)鏈大多基于叔丁基(But),因此,也稱為FMOC-But策略。同時(shí),在多肽合成樹脂,縮合試劑以及氨基酸保護(hù),包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。
進(jìn)入21世紀(jì),隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入,對(duì)于多肽化學(xué)的要求不僅僅是合成方法,而更多的集中在多肽標(biāo)記與修飾方法,以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成以及長(zhǎng)肽或蛋白合成。
多肽化學(xué)合成的基本介紹
多肽化學(xué)合成方法,包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現(xiàn)在主要采用BOC和Z兩種保護(hù)方法,現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成,如阿斯巴甜,力肽,催產(chǎn)素等,其相對(duì)與固相合成,具有保護(hù)基選擇多,成本低廉,合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點(diǎn)。與固相合成比較,液相合成主要缺點(diǎn)是,合成范圍小,一般都集中在10個(gè)氨基酸以內(nèi)的多肽合成,還有合成中需要對(duì)中間體進(jìn)行提純,時(shí)間長(zhǎng),工作量大。固相合成方法現(xiàn)在主要采用FMOC和BOC兩種方法,它具有合成方便,迅速,容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,而且可以比較容易的合成到30個(gè)氨基酸左右多肽。
1.1.氨基酸保護(hù)基
20種常見氨基酸,根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類:脂肪族氨基酸(Ala,Gly,Val,Leu,Ile,),芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp,His),酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸(Asp,Glu,Asn,Gln),堿性側(cè)鏈氨基酸(Lys,Arg),含硫氨基酸(Cys,Met),含醇氨基酸(Ser,Thr),亞氨型基酸(Pro)。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵,直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。因?yàn)槌R姷?0中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的,需要進(jìn)行保護(hù),一般要求,這些保護(hù)基在合成過程中穩(wěn)定,無(wú)副反應(yīng),合成結(jié)束后可以完全定量的脫除。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括:Cys,Asp,Glu,His,Lys,Asn,Gln,Arg,Ser,Thr,Trp,Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán):羥基,羧基,巰基,氨基,酰胺基,胍基,吲哚,咪唑等。其中Trp也可以不保護(hù),因?yàn)檫胚嵝再|(zhì)比較穩(wěn)定。當(dāng)然在特殊的情況下,有些氨基酸也可以不保護(hù),象,Asn,Gln ,Thr,Tyr。
表1 常見3種氨基脫除條件
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TFA
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HBr/TFA
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H2/Pd-C
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Piperidine/DMF
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Boc
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y
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y
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n
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n
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Z
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n
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y
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y
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n
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Fmoc
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n
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y
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n
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y
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(圖1 常見3種氨基保護(hù)基結(jié)構(gòu))
氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)非常多,同一個(gè)側(cè)鏈有多種不同的保護(hù)基,可以在不同的條件下選擇性的脫除,這點(diǎn)在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側(cè)鏈保護(hù)基和選擇的合成方法有密切的關(guān)系,液相和固相不一樣,固相中BOC和FMOC策略也不一樣,從某種意義上看,多肽化學(xué)就是氨基酸保護(hù)基的靈活運(yùn)用與搭配。關(guān)于側(cè)鏈保護(hù)基的使用,請(qǐng)參考王德心的《固相有機(jī)合成——原理及應(yīng)用指南》第四章,我們這里主要介紹Cys,Lys,Asp的幾種保護(hù)基及其脫除方法。Cys最常見的保護(hù)基有三種,Trt,Acm,Mob,這三個(gè)保護(hù)基可以完成多對(duì)二硫鍵多肽的合成。Lys最常見的保護(hù)基有:Boc,F(xiàn)moc,Trt,Dde,Allyl,這對(duì)于固相合成環(huán)肽提供了很多正交的保護(hù)策略。Asp最常見的保護(hù)基有:Otbu,OBzl,OMe,OAll,OFm,同樣也提供了多種正交的保護(hù)策略。
表2 巰基常見保護(hù)基
簡(jiǎn)稱
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結(jié)構(gòu)
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脫除條件
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Trt
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TFA,HCl/HOAc,I2/MeOH
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Acm
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I2/MeOH,Hg2+
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Mob
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HF,TFMSA,Hg2+
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(表3 氨基常見保護(hù)基)
簡(jiǎn)稱
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結(jié)構(gòu)
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脫除條件
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Trt
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TFA,HOAc,HCOOH
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Boc
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HCl/HOAc,TFA/DCM
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Fmoc
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Pip/DMF,NaOH/MeOH
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Dde
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H2NNH2/DMF
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Allyl
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Pd(Ph3P)4,嗎啉/THF
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(表4 羧基常見保護(hù)基)
簡(jiǎn)稱
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結(jié)構(gòu)
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脫除條件
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Otbu
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TFA,HOAc,HCOOH
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OBzl
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H2/Pd,HF,TFMSA
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OMe
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NaOH/MeOH
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OAll
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Pd(Ph3P)4,嗎啉/THF
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OFm
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Pip/DMF,DBU/DMF
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1.2.多肽縮合試劑
目前多肽合成中,主要采用羧基活化方法來(lái)完成接肽反應(yīng),最早使用的是將氨基酸活化為酰氯,疊氮,對(duì)稱酸酐以及混合酸酐的方法,但是由于這些條件下,存在氨基酸消旋,以及反應(yīng)試劑危險(xiǎn)以及制備比較復(fù)雜,逐漸被后來(lái)的縮合試劑取代,按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種:縮合試劑主要有:碳二亞胺型,鎓鹽型(Uronium)。
1.2.1.碳二亞胺型
主要包括:DCC,DIC,EDC.HCl等。采用DCC進(jìn)行反應(yīng),由于反應(yīng)中生成的DCU,在DMF中溶解度很小,產(chǎn)生白色沉淀,所以一般不用在固相合成中,但是由于其價(jià)格便宜,在液相合成中,可以通過過濾除去,應(yīng)用仍然相當(dāng)廣泛。EDC.HCl因?yàn)槠渌芙庑缘奶攸c(diǎn),在多肽與蛋白的連接中使用比較多,而且也相當(dāng)成功。但是該類型的縮合試劑的一個(gè)最大的缺點(diǎn),就是如果單獨(dú)使用,會(huì)有比較多的副反應(yīng),但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt,HOAt等試劑,可以將其副反應(yīng)控制在很低的范圍。其反應(yīng)機(jī)理如下:
(圖2 DIC活化反應(yīng)機(jī)理)
1.2.2.鎓鹽型
鎓鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高,速度快,現(xiàn)在使用非常廣泛,主要包括:HBTU,TBTU,HATU,PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機(jī)堿,如,二異丙基乙胺(DIEA),N-甲基嗎啉(NMM),該試劑加入后,才能活化氨基酸。其反應(yīng)機(jī)理如下:
(圖3 TBTU活化反應(yīng)機(jī)理)
1.3.多肽合成方法比較
1.3.1.液相多肽合成(solution phase synthesis)
液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用,在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大,合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn),而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng),可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富,象一些催化氫化,堿性水解等條件,都可以使用,這在固相中,使用卻由于反應(yīng)效率低,以及副反應(yīng)等原因,無(wú)法應(yīng)用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略。
(圖4液相合成Glu-Trp)
1.3.2.固相多肽合成
(圖5 FMOC固相合成Glu-Trp)
固相多肽合成現(xiàn)在使用的主要有兩種策略:BOC和FMOC兩種。BOC方法合成過程中,需要反復(fù)使用TFA脫BOC,而且在最后從樹脂上切割下來(lái)需要使用HF,由于HF必須使用專門的儀器進(jìn)行操作,而且切割過程中容易產(chǎn)生副反應(yīng),因此現(xiàn)在使用受到實(shí)驗(yàn)條件限制,使用也逐漸減少。FMOC方法反應(yīng)條件溫和,在一般的實(shí)驗(yàn)條件下就可以進(jìn)行合成,因此,也得到了非常廣泛的應(yīng)用。
1.3.2.1.固相合成中常用樹脂
固相合成中樹脂,一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料,大小在75-150μm,交聯(lián)度在1-2%之間,現(xiàn)在使用的大多是1%,因?yàn)檫@種交聯(lián)度下,樹脂在DMF,DCM中具有很好的溶脹性能,立體上是一個(gè)空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),反應(yīng)物分子可以在樹脂內(nèi)部自由移動(dòng)。樹脂中最關(guān)鍵的部分是連接手臂,它一端連接在樹脂上,一端作為反應(yīng)位點(diǎn)。目前廣泛使用的樹脂有:PAM,MBHA,Wang,2-Cl-Trt,Rink-Amide-MBHA等。其中PAM,MBHA是用在BOC策略中,因?yàn)槠鋵?duì)酸非常穩(wěn)定,需要在HF,TFMSA等強(qiáng)酸條件下才能夠切割下來(lái)。
(圖6 固相合成常用樹脂)
1.3.2.2.茚三酮檢測(cè)
固相多肽合成中,主要是通過檢測(cè)樹脂上游離氨基來(lái)判斷連接效率,檢測(cè)方法稱為Kaiser方法,其檢測(cè)結(jié)果,如果有游離氨基的時(shí)候,顯示蘭色,或紅褐色(pro,ser,His)。
Kaiser試劑包括:
A,6% 茚三酮的乙醇溶液
B,80% 苯酚的乙醇溶液
C,2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經(jīng)過茚三酮處理后,重蒸后再使用。檢測(cè)過程,取少量樹脂,加入A,B,C各2-3滴,100℃下加熱1-2min,如果溶液有蘭色,或樹脂出現(xiàn)蘭色,紅褐色,表明還有游離氨基,否則說(shuō)明連接完全。
還有其它檢測(cè)游離氨基的方法:三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬蘭法等。
(圖7 茚三酮檢測(cè)原理)
1.3.2.3.固相合成切割方法
固相合成完成之后,必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來(lái),然后經(jīng)過冰乙醚沉淀,離心收集沉淀,經(jīng)過HPLC分離純化,冷凍干燥得到最后產(chǎn)品。由于選擇的樹脂不同,氨基酸序列不同,在切割時(shí)候,選擇的切割方法也不完全相同,一般都是選擇酸性條件下切割的條件,對(duì)于PAM,MBHA樹脂,一般采用HF切割,切割過程中需要添加對(duì)甲苯酚,對(duì)巰基苯酚,苯甲醚等試劑。而對(duì)于Wang,Rink-Amide,Trt樹脂,一般采用TFA切割,切割過程中加入,乙二硫醇,苯甲硫醚,水,三異丙基硅烷,苯酚等。這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用,目的是俘獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子,減少這些碳正離子對(duì)部分氨基酸側(cè)鏈的進(jìn)攻導(dǎo)致的副反應(yīng),比較容易產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有:Trp,Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比:HF/p-cresol/p-thiocresol(90/5/5),TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5),反應(yīng)一般是在室溫條件下2h-4h。
1.3.3.多肽合成中主要問題
1.3.3.1.消旋及其反應(yīng)機(jī)理
多肽合成過程中,部分氨基酸在活化的過程中會(huì)導(dǎo)致不同程度的消旋,特別容易消旋的氨基酸有:Cys,His,Phe,當(dāng)然這些消旋化還和溶劑,溫度以及合成中的有機(jī)堿等因素有關(guān)。對(duì)于這些氨基酸,可以通過采用高效縮合試劑,減少反應(yīng)時(shí)間,可以減少消旋的比例,一般條件選擇適當(dāng),消旋化都可以控制在5%以內(nèi)。消旋反應(yīng)機(jī)理如下:
(圖8 消旋反應(yīng)機(jī)理 )
1.3.3.2.二酮哌嗪(DKP)反應(yīng)
DKP副反應(yīng)出現(xiàn)在FMOC-Wang樹脂合成過程中,主要出現(xiàn)在第一個(gè)氨基酸為Pro的時(shí)候,當(dāng)?shù)诙€(gè)氨基酸脫FMOC的時(shí)候,α-氨基被游離出來(lái)之后,立即對(duì)Wang樹脂的芐酯鍵進(jìn)行分子內(nèi)胺解,生成六元環(huán)二酮哌嗪衍生物,同時(shí)從Wang樹脂上釋放出來(lái),導(dǎo)致反應(yīng)終止。該反應(yīng)非常迅速,文獻(xiàn)報(bào)道采用50%Pip/DMF,脫1min,4min的條件,但是我們實(shí)驗(yàn)證明在多數(shù)情況下,即使是1min左右反應(yīng)就超過了20%。因此一般在末端第一個(gè)氨基酸為Pro的時(shí)候,建議采用2-Cl-Trt樹脂合成,由于該樹脂巨大的空間阻力,可以完全消除該副反應(yīng)。這個(gè)副反應(yīng)在BOC策略合成過程中,卻可以完全避免,因?yàn)锽OC在使用TFA脫除后,使氨基以TFA鹽的形式存在,從而失去了親核性,不能進(jìn)攻芐酯鍵。
(圖9 DKP反應(yīng)機(jī)理)
1.3.3.3.困難序列多肽合成
固相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題,這里面的主要原因是由于多肽序列引起的,因?yàn)橛行┒嚯男蛄性跇渲闲纬?beta;-折疊,改變了樹脂的溶脹性能,還有可能將反應(yīng)的活性位點(diǎn)埋藏在樹脂里面,這樣使得反應(yīng)很難進(jìn)行,目前報(bào)道使用的主要方法有:
使用混合溶劑,DMSO/DMF,6N 胍啶/DMF溶液
提高反應(yīng)溫度,或采用微波方法
使用高離液鹽,LiCl,NaClO4等。
使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂,同時(shí)減少樹脂擔(dān)載量(0.05-0.2mmol/g)
1.4.合成多肽分析鑒定方法
多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu),二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定,多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括:質(zhì)譜分析,氨基酸組成分析,氨基酸序列分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括:圓二色譜(CD),NMR,X-衍射等方法。
1.4.1.純度分析
多肽的純度分析,一般都采用HPLC進(jìn)行分析,選擇RP-C18,粒徑5μm,孔徑300A,4.6×150mm,流動(dòng)相:A,0.1% TFA/H2O;B,0.1% TFA/ACN,洗脫梯度,5%B--65%B,時(shí)間30min。也有些多肽,特別是短肽,由于親水性強(qiáng),在C18上保留很弱,需要改變條件,這里主要有兩種方法:一個(gè)改變分析梯度,可以將起始梯度改為2%,等度或小梯度洗脫;另外一個(gè)方法是在流動(dòng)相中加入強(qiáng)離子對(duì)試劑,如七氟丁酸,十八烷基磺酸鈉等。
1.4.2.一級(jí)結(jié)構(gòu)分析
1.4.2.1.質(zhì)譜分析
質(zhì)譜分析的目的主要是確證分子量,當(dāng)然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息,但是這個(gè)需要比較全的數(shù)據(jù)庫(kù)作為基礎(chǔ),分析才能比較準(zhǔn)確。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定,需要采用軟電離技術(shù),目前多肽分析主要使用了電噴霧(ESI-MS),基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI-MS)。其中ESI-MS通常會(huì)給出多電荷峰,電荷數(shù)目和多肽序列上氨基,胍基,咪唑基的數(shù)目有關(guān),因此,經(jīng)常給出了雙電荷,三電荷等離子峰。MALDI-MS可以分析蛋白大分子,而且通常情況下很少帶多電荷,因此數(shù)據(jù)直接對(duì)應(yīng)了分子離子峰,容易分析。此外,通常在分析長(zhǎng)肽或蛋白過程中,需要添加NH4,Na,K等離子,提高靈敏度,所以一般在MS中出現(xiàn)一組峰,分別對(duì)應(yīng):(M+H)+,(M+NH4)+,(M+Na)+,(M+K)+。
1.4.2.2.氨基酸組成分析
氨基酸組成分析一般需要產(chǎn)品的純度較高,它可以給出多肽中氨基酸的種類,數(shù)目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵,典型酸水解的條件是:真空條件下,110℃,用6M鹽酸水解16至72小時(shí)。酸水解雖然很有用,但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析,因?yàn)樘於0泛凸劝滨0返膫?cè)鏈含有酰胺鍵,用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉(zhuǎn)換為天冬氨酸,谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸。由于水解溫度比較高,色氨酸的吲哚環(huán)容易被空氣氧化,即使在密封的管中,色氨酸的吲哚環(huán)也幾乎都被破壞了。因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸收光譜估計(jì)的,也可以通過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能精確測(cè)定,要精確測(cè)量需要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或羧甲基化,形成的衍生物在酸水解之后才能定量。
1.4.2.3.氨基酸序列分析
氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解,主要涉及耦聯(lián)、水解、萃取和轉(zhuǎn)換等4個(gè)過程。首先使用苯異硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的堿性條件下對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理,PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng),形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸處理,N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷,釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來(lái)將該衍生物用有機(jī)溶劑(例如氯丁烷)從反應(yīng)液中萃取出來(lái),而去掉了一個(gè)N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來(lái)的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩(wěn)定,經(jīng)酸作用,再進(jìn)一步環(huán)化,形成一個(gè)穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個(gè)氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過程,整個(gè)測(cè)序過程現(xiàn)在都是通過測(cè)序儀自動(dòng)進(jìn)行。
1.4.3.二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
1.4.3.1.圓二色譜(CD)
圓二色譜是一種特殊的吸收譜,它通過測(cè)量蛋白質(zhì)等生物大分子的圓二色光譜,從而得到生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu),簡(jiǎn)單、快捷,廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊,蛋白質(zhì)構(gòu)象研究,酶動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域。圓二色譜紫外區(qū)段(190-240nm),主要生色團(tuán)是肽鏈,這一波長(zhǎng)范圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。α-螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm、208nm處呈負(fù)峰,在190nm附近有一正峰。β-折疊構(gòu)象的CD譜,在217-218nm處有一負(fù)峰,在195-198nm處有一強(qiáng)的正峰。無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜在198nm附近有一負(fù)峰,在220nm附近有一小而寬的正峰。
1.4.3.2.核磁共振(NMR)
隨著二維、三維以及四維NMR的應(yīng)用,分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展,使NMR逐漸成為大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、分布以及構(gòu)象。目前,NMR在分析分子中含少于30個(gè)氨基酸的小肽時(shí)是非常有用的,分析結(jié)果快速準(zhǔn)確。
1.4.3.3.X-衍射
X-衍射可獲得有關(guān)化合物晶型的直接信息,而且可以判斷相對(duì)與絕對(duì)構(gòu)型。
多肽標(biāo)記及修飾
目前多肽標(biāo)記及修飾的內(nèi)容非常多,廣泛應(yīng)用在多肽藥物,多肽生物學(xué),多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應(yīng)用廣泛的有:非放射性核素標(biāo)記(C13,H2),熒光標(biāo)記(FAM,F(xiàn)ITC),生物素標(biāo)記,磷酸化修飾等。
2.1.非放射性核素標(biāo)記
目前在非放射性核素標(biāo)記中,使用廣泛的仍然是C13,H2,因?yàn)槠涫褂冒踩派湫孕 ,F(xiàn)在有比較完全的非放射性標(biāo)記的氨基酸,可以按照正常的多肽合成方法將標(biāo)記好的氨基酸直接連接到多肽上。
2.2.熒光標(biāo)記
熒光標(biāo)記由于沒有放射性,實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。因此,目前在生物學(xué)研究中熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛,熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系,對(duì)于有游離羧基的采用的方法與接肽反應(yīng)相同,也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對(duì)于FITC標(biāo)記,需要在連接FITC前,增加一個(gè)氨基己酸,避免在切割的過程中被TFA切割掉。
2.3.生物素標(biāo)記
生物素-親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system,BAS),是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué),并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級(jí)放大效應(yīng),并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合,使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。主要有用于標(biāo)記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對(duì)硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用,當(dāng)然,也可以直接使用生物素也可以標(biāo)記,因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上有個(gè)游離的羧基,采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合,由于生物素的溶解度低,使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。
2.4.磷酸肽合成
磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用,磷酸化的位置在多肽上的Ser,Thr,Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸,目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸,Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法,但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點(diǎn),特別是在合成多磷酸化多肽或長(zhǎng)肽的時(shí)候,連接效率低,最后產(chǎn)品純度很低,對(duì)于這種磷酸化多肽,我們考慮采用后磷酸化方法,其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后,選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基,對(duì)于Tyr,Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng),而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt),在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化,采用雙芐基亞磷酰胺,四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體,連接到羥基上,隨后在過氧酸下氧化生成磷?;?,完成反應(yīng)。
蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽
多肽在與蛋白受體結(jié)合發(fā)揮功能的時(shí)候,總是先折疊出某些特殊的結(jié)構(gòu),多肽類似物合成主要是為了模擬這些結(jié)構(gòu),保持或提高生物活性,同時(shí)也為了改變多肽的穩(wěn)定性,提高其抗酶解能力。
3.1.α-螺旋多肽
α-螺旋是蛋白結(jié)構(gòu)中最為普通的一種,但是一般多肽在溶液中大多是無(wú)規(guī)卷曲的,目前使用最多的方法是多肽保持α-螺旋結(jié)構(gòu)就是在多肽表面通過共價(jià)鍵將處在α-螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)氨基酸連接起來(lái),選擇的位點(diǎn)(i,i+4或i,i+7),選擇的化學(xué)鍵包括:二硫鍵,硫醚鍵,酰胺鍵,烯烴鍵(RCM)等方法。
3.1.1.二硫鍵
二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中,對(duì)穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義,二硫鍵一般是通過序列中的2個(gè)Cys的巰基,經(jīng)氧化形成。形成二硫鍵的方法很多:空氣氧化法,DMSO氧化法,過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程,可以通過Ellman檢測(cè)以及HPLC檢測(cè)方法對(duì)其反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
3.1.2.硫醚鍵
硫醚鍵的形成可以通過序列中的Lys,將溴乙酸連接到Lys的側(cè)鏈氨基上,利用其和巰基的特異性反應(yīng),反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行,迅速高效。
3.1.3.酰胺鍵
多肽的內(nèi)酰胺環(huán)肽的合成一般是利用Lys,Asp(Glu)的選擇性保護(hù),在固相上直接環(huán)化。BOC策略中可以采用BOC-Lys(Fmoc),BOC-Asp(OFm),F(xiàn)MOC策略中可以采用FMOC-Lys(Aloc),F(xiàn)MOC-Asp(Allyl)。對(duì)于首尾環(huán)肽,還可以先合成保護(hù)的多肽,然后在液相中環(huán)化生成目標(biāo)多肽。
3.1.4.烯烴鍵(RCM)
RCM反應(yīng)是一個(gè)過渡金屬催化反應(yīng),其反應(yīng)中使用催化劑:(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh,可以催化烯烴環(huán)化,過程中脫去一分子乙烯。
(圖10 固相RCM反應(yīng) )
該反應(yīng)也可以在固相樹脂上直接環(huán)化,反應(yīng)條件:15-25% (Cy3P)2Cl2Ru=CHPh DCM,60-80℃,24-48h。
3.2.TASP(template-assembled synthetic peptide)多肽
瑞士Basel大學(xué)的化學(xué)家首次提出TASP的概念,他們利用具有“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的肽鏈作為模板,然后將具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽直接連接到模板上,模擬蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。
3.3.長(zhǎng)肽或蛋白合成
3.3.1.FMOC-tbu片段縮合方法
FMOC-tbu片段縮合方法在合成長(zhǎng)肽以及蛋白上面運(yùn)用非常廣泛,其合成過程首先是合成保護(hù)性肽片段,經(jīng)過純化后,將幾個(gè)片段在液相或固相上組裝起來(lái)。使用本方法主要注意幾個(gè)方面:片段的選擇,片段的合成與純化,片段縮合方法。片段選擇要考慮到片段連接反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),容易導(dǎo)致消旋,故片段的C末端最好選擇Gly,Pro。合成的片段一般需要經(jīng)過C4,C8等純化,對(duì)于溶解性很差的多肽,可以采用硅膠柱層析方法進(jìn)行純化。由于片段的分子大,在樹脂內(nèi)移動(dòng)速度慢,故反應(yīng)時(shí)間一般都很長(zhǎng),而且反應(yīng)過程中與片段濃度關(guān)系很大,溶解的時(shí)候,盡量提高片段的濃度。對(duì)多種條件的選擇,發(fā)現(xiàn)采用DMF為溶劑,DIC/HOBt的方法縮合效率最高,消旋也最小。
(圖11 FMOC-tbu片段縮合示意圖)
3.3.2.自然化學(xué)連接(Native Chemical Ligation)
自然化學(xué)連接方法的優(yōu)點(diǎn)是可以采用完全脫保護(hù)的多肽,因此不存在溶解性問題,其反應(yīng)也是在緩沖水溶液中進(jìn)行,由于其利用的是巰基和硫酯的特異性反應(yīng),再經(jīng)過由S到N的轉(zhuǎn)變完成肽鍵的合成。
(圖13自然化學(xué)連接)
總之,今后多肽化學(xué)的研究,不僅是將更多的有機(jī)化學(xué)合成新方法,新技術(shù)引入到多肽研究當(dāng)中,而且對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)以及功能模擬,開展結(jié)構(gòu)活性研究(structure activity relationship)將是研究開發(fā)的熱點(diǎn),因?yàn)檫@將為揭示蛋白的內(nèi)在的生物活性本質(zhì)提供大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
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多肽合成技巧
N末端的生物素標(biāo)記
Wash 0.1 mmol resin with DMF.
Dissolve 0.244 g (+)-biotin (1 mmol, MW 244.3) in 5 mL DMF-DMSO (1:1) solution. A little warming is necessary.
Add 2.1 mL 0.45 M HBTU/HOBt solution and 0.3 mL DIEA to the solution prepared in step 2.
Add the activated biotin solution to the resin and let stir overnight.
Check resin to make sure coupling is complete as evidenced by negative ninhydrin test (colorless).
Wash resin with DMF-DMSO (1:1) (2x) to remove excess (+)-biotin.
Wash resin with DMF (2x) and DCM (2x).
Let the resin dry before proceeding to cleavage.
在2-氯TRT樹脂上掛第一個(gè)FMOC氨基酸的方法
Weigh 10 g 2-chlorotrityl chloride resin (15 mmol) in a reaction vessel, wash with DMF (2x), swell the resin in 50 mL DMF for 10 min, drain vessel.
Weigh 10 mmol Fmoc-amino acid in a test tube, dissolve Fmoc-amino acid in 40 mL DMF, transfer the solution into the reaction vessel above, add 8.7 mL DIEA (50 mmol), swirl mixture for 30 min at room temperature.
Add 5 mL methanol into the reaction vessel and swirl for 5 min.
Drain and wash with DMF (5x).
Check substitution.
Add 50 mL 20% piperidine to remove the Fmoc group. Swirl mixture for 30 min.
Wash with DMF (5x), DCM (2x), put resin on tissue paper over a foam pad and let dry at room temperature overnight under the hood. Cover the resin with another piece of tissue paper, press lightly to break aggregates.
Weigh loaded resin.
Pack in appropriate container.
檢測(cè)樹脂上面是否掛上第一個(gè)FMOC氨基酸的方法
Weigh duplicate samples of 5 to 10 mg loaded resin in an eppendorf tube, add 1.00 mL 20% piperidine/DMF, shake for 20 min, centrifuge down the resin.
Transfer 100 µL of the above solution into a tube containing 10 mL DMF, mix well.
Pipette 2 mL DMF into each of the two cells (reference cell and sample cell), set spectrophotometer to zero. Empty the sample cell, transfer 2 mL of the solution from step 2 into the sample cell, check absorbance.
Subs = 101(A)/7.8(w)
A = absorbance
w = mg of resin
Check absorbance three times at 301 nm, calculate average substitution.
FMOC方法合成多肽操作步驟 (0.25 mmol)
Wash resin with DMF (4x) and then drain completely.
Add approximately 10 mL 20% piperidine/DMF to resin. Shake for one min and drain.
Add another 10 mL 20% piperidine/DMF. Shake for 30 min.
Drain reaction vessel and wash resin with DMF (4x). Make sure there is no piperidine remaining. Check beads using ninhydrin test, beads should be blue.
Coupling Step - Prepare the following solution:
1 mmol Fmoc-amino acid
2.1 mL 0.45 M HBTU/HOBT (1mmol)
348 µL DIEA (2 mmol)
Add above solution to the resin and shake for a minimum of 30 min. This coupling step can be longer if desired.
Drain reaction vessel and wash resin with DMF (4x).
Perform Ninhydrin test:
If negative (colorless), proceed to step 2 and continue synthesis.
If positive (blue), return to step 5 and re-couple the same Fmoc-amino acid. Increase the coupling time if necessary.