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擴(kuò)展遺傳密碼：有義密碼子重新分配
化學(xué)和合成生物學(xué)的驅(qū)動(dòng)動(dòng)機(jī)之一是擴(kuò)展可用于生物聚合物模板合成的構(gòu)建塊集?？捎糜诜g的氨基酸組的擴(kuò)展尤其具有挑戰(zhàn)性。所有 64 個(gè)密碼子三聯(lián)體都具有指定功能這一事實(shí)阻礙了遺傳密碼的擴(kuò)展。然而，遺傳密碼是簡并的：61 個(gè)有義密碼子指定了 20 個(gè)典型氨基酸。

通過重新分配有義密碼子的含義來擴(kuò)展遺傳密碼應(yīng)該可以廣泛推廣。不幸的是，由于每個(gè)生物體的 tRNA 和氨酰 tRNA 合成酶 (aaRS) 補(bǔ)體的大部分未知和異質(zhì)的識(shí)別和辨別特征，預(yù)測哪些有義密碼子適合重新分配以及哪些正交機(jī)制最適合該任務(wù)變得具有挑戰(zhàn)性。

我們正在通過打破遺傳密碼的簡并性來打開新的密碼子進(jìn)行重新分配。此外，我們將有義密碼子重新分配技術(shù)與用于響應(yīng)琥珀終止密碼子的非規(guī)范氨基酸摻入的改進(jìn)技術(shù)相結(jié)合，以生成 22 和 23 個(gè)氨基酸代碼，其中多個(gè)非規(guī)范氨基酸的多個(gè)拷貝可以摻入感興趣的蛋白質(zhì)中. 改進(jìn)的技術(shù)以及目前可用的套件結(jié)合酶的非規(guī)范氨基酸將可用遺傳密碼的數(shù)量從 100 個(gè)擴(kuò)展到 10,000 個(gè)到 1,000,000 個(gè)（從 21 (~200) 到 22 (~100)2 到 23 (~100)3 個(gè)密碼）探索和利用蛋白質(zhì)序列和功能空間的遠(yuǎn)景。通過重新分配有義密碼子的含義來打破遺傳密碼的簡并性，為進(jìn)行生物合成修飾提供了額外的途徑，從而促進(jìn)了基礎(chǔ)和應(yīng)用生化研究。

Fisk Lab 的基于熒光的有義密碼子重新分配屏幕。我們的篩選評(píng)估了反密碼子修飾的 tRNA 結(jié)合酪氨酸 (Tyr) 以響應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌遺傳密碼中分配了另一個(gè)身份的有義密碼子的能力。超級(jí)文件夾 GFP 的殘基 65-67 指定了自動(dòng)化折疊成三肽熒光團(tuán)的 Thr-Tyr-Gly 序列。用任何其他天然氨基酸替換第 66 位的 Tyr 可有效消除蛋白質(zhì)的熒光。(生物化學(xué), 2015, 54 (50), pp 7355–7364)
噬菌體展示和基于噬菌體的材料
我們正在探索開發(fā)高度修飾的噬菌體顆粒作為傳統(tǒng)抗體試劑的替代品。這些新組件通過組合獲得改進(jìn)的特性將生物識(shí)別和信號(hào)檢測部分作為細(xì)菌病毒顆粒的附屬物呈現(xiàn)。在粒子上顯示多個(gè)結(jié)合和信號(hào)分子的能力可以通過兩種方式改善行為：增加響應(yīng)的可調(diào)性（通過控制可用結(jié)合分子的數(shù)量）和通過親合力效應(yīng)提高靈敏度。以類似的方式，在粒子上顯示多個(gè)信號(hào)生成組件的能力可以導(dǎo)致更穩(wěn)健的響應(yīng)。信號(hào)放大可以通過將多個(gè)熒光或催化結(jié)構(gòu)域連接到顆粒上來實(shí)現(xiàn)：一個(gè)結(jié)合事件可以固定 10 到 100 的熒光分子或酶。因?yàn)閭鞲衅鞯乃薪M件都是作為噬菌體生命周期過程的一部分創(chuàng)建和組裝的，這些傳感器的制造成本將非常低廉。噬菌體顆粒已被證明可以增加附加在它們上面的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這種效果可能會(huì)延長基于噬菌體的傳感器組件的保質(zhì)期。我們正在努力開發(fā)這些類型的試劑作為診斷的組成部分，非常適合資源匱乏地區(qū)的挑戰(zhàn)和需求。然而，基于噬菌體的傳感器的低成本、易用性和長保質(zhì)期可能會(huì)在所有醫(yī)療保健環(huán)境中產(chǎn)生變革。

Fisk 實(shí)驗(yàn)室有興趣為噬菌體展示文庫鑒定新的支架蛋白。我們已經(jīng)成功地從基于 65 個(gè)氨基酸的超嗜熱支架蛋白 Sso7d 的文庫中識(shí)別出針對(duì)各種蛋白質(zhì)靶標(biāo)的緊密特異性結(jié)合分子。(FEBS J, 2016, 283, pp 1351–1367)

M13 生命周期的計(jì)算模擬

當(dāng)試圖建立一個(gè)具有定義功能的復(fù)雜生物技術(shù)系統(tǒng)時(shí)，從哪里開始？當(dāng)今可用的生物技術(shù)基礎(chǔ)設(shè)施的許多基本遺傳成分（例如 DNA 質(zhì)粒構(gòu)建體、啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)）是隨機(jī)游走對(duì)從無數(shù)生物體中選擇的部分進(jìn)行增量更改的結(jié)果，而不是經(jīng)過仔細(xì)、深思熟慮的系統(tǒng)設(shè)計(jì)具有以清晰易懂的方式運(yùn)作的特定功能。雖然分子生物學(xué)和生物工程通過結(jié)合這些部分而蓬勃發(fā)展，但合成生物學(xué)和生物工程的下一個(gè)重大飛躍將是能夠?qū)⒐こ淘O(shè)計(jì)周期強(qiáng)加于生物結(jié)構(gòu)和功能。Fisk 實(shí)驗(yàn)室的研究旨在為基礎(chǔ)和應(yīng)用層面的下一步做出貢獻(xiàn)。這種方法必須從了解自然的復(fù)雜性開始，特別是通過形成對(duì)生物相互作用的定量描述。定量生物學(xué)能夠構(gòu)建定量模型，從而將新的有用功能定向工程化到生物系統(tǒng)中。

隨著 M13 噬菌體顆粒的生物技術(shù)應(yīng)用范圍和復(fù)雜性不斷擴(kuò)大，對(duì)控制噬菌體生命周期的生物過程和相互作用的定量、整體理解將促進(jìn)創(chuàng)建具有合理設(shè)計(jì)的控制元件的新平臺(tái)，這些控制元件更適合工程。我們受到 John Yin 實(shí)驗(yàn)室 Drew Endy 和 Lingchong You 的工作的啟發(fā)，他們通過化學(xué)動(dòng)力學(xué)模擬定量描述了裂解 T7 噬菌體的生物學(xué)。他們指出，我們也相信，在包括系統(tǒng)中所有生物組件的水平上理解生物學(xué)，并考慮它們的產(chǎn)生、相互作用和功能的時(shí)間，是真正的、基于模型的生物工程的必要起點(diǎn)。系統(tǒng)。

我們構(gòu)建了一個(gè)基于基因結(jié)構(gòu)、基于實(shí)驗(yàn)的非裂解性絲狀噬菌體 M13 生命周期的計(jì)算模擬，以評(píng)估和擴(kuò)展對(duì)這種生物技術(shù)相關(guān)病毒的系統(tǒng)級(jí)理解。我們的確定性化學(xué)動(dòng)力學(xué)模擬整合了 50 年的實(shí)驗(yàn)觀察，并明確包括噬菌體 DNA 復(fù)制、mRNA 轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯和噬菌體顆粒組裝的分子細(xì)節(jié)，以及控制時(shí)間的競爭性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-核酸相互作用和噬菌體產(chǎn)生的程度。模擬忠實(shí)地再現(xiàn)了 M13 生物學(xué)的許多方面，包括復(fù)制形式的合成和預(yù)組裝復(fù)雜 DNA 之間轉(zhuǎn)換的生產(chǎn)水平和時(shí)間、噬菌體 mRNA 和蛋白質(zhì)的數(shù)量、模擬是對(duì)控制 M13 生物學(xué)的整套相互作用進(jìn)行定量理解的過程中的重要一步。該模擬為研究噬菌體成分之間的復(fù)雜相互作用提供了一個(gè)平臺(tái)，并且是一種預(yù)測生產(chǎn)性重新設(shè)計(jì)點(diǎn)的工具。

Fisk 實(shí)驗(yàn)室有興趣利用自我復(fù)制、自我組裝的 M13 噬菌體顆粒作為多價(jià)、多功能生物技術(shù)的平臺(tái)。這個(gè)目標(biāo)需要對(duì)整個(gè) M13 生命周期所涉及的定量生物學(xué)有一個(gè)完整的了解。我們開發(fā)和利用整個(gè) M13 生命周期的化學(xué)動(dòng)力學(xué)模擬的前兩篇論文已經(jīng)發(fā)表。（病毒學(xué)，2016 年，http://dx.doi.org/10.1016/j.virol.2016.08.017 和 http://dx/doi.org/10.1016/j.virol.2016.08.015）