背景及概述

多肽具有一個顯著的結(jié)構(gòu)性優(yōu)勢，即可以在不影響原有功能性多肽片段的基礎(chǔ)上，通過固相合成或生物合成，在多肽的一端或兩端引入新的功能性多肽序列，獲得多功能性融合肽。 這種具有受體/配體結(jié)合能力的pH 敏感脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞的機制，往往不同于普通脂質(zhì)體的融合方式。如類似ＲGD/αV β3或者Transferrin /TfＲ的結(jié)合方式，會誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞主動內(nèi)吞脂質(zhì)體繼而釋放藥物/核酸，此類多肽修飾的pH 敏感脂質(zhì)體藥物/核酸釋放過程。常見的多肽修飾物按照修飾位點可分為四大類：C 末端修飾(酰胺化、硫酸酯化等)、N 末端修飾(乙?；?、脂肪酸化等)、中間殘基修飾(與Se r-、Ty r-、A sn-、Thr-結(jié)合的糖基化修飾；與Ser-、Ty r-、Thr-結(jié)合的磷酸化修飾等)以及環(huán)化修飾。目前對多肽修飾的研究已經(jīng)成為熱點。

修飾方法

1.化學(xué)法

是目前多肽修飾中研究最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的修飾方法，它主要包括液相法和固相法。

1）液相法

液相法是一種經(jīng)典的方法，在純度監(jiān)測和規(guī)?；a(chǎn)等方面具有獨特優(yōu)勢。在肽的環(huán)化修飾中，為避免發(fā)生分子間反應(yīng)生成線性或環(huán)狀的二聚體和多聚體，反應(yīng)需要在高度稀釋的溶液中進(jìn)行(10-3 ～10-4 mol/ L)。但在此高度稀釋的條件下，常存在反應(yīng)時間延長、副反應(yīng)較多等局限性，給后處理增加不便。針對這種情況，使用一種空間位阻大的樹突狀硅烷取代碳二亞胺作為縮合劑，代替常規(guī)試劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)進(jìn)行溶液方式的內(nèi)酰胺環(huán)肽合成，得到純度很高的目標(biāo)化合物。

2）固相法

固相法因為易于分離純化而廣泛應(yīng)用在肽修飾中，采用此法合成的肽修飾物其產(chǎn)率和分離純度也明顯高于采用液相法。在固相肽合成中，C 末端氨基酸殘基與載體相連后再組裝剩余氨基酸，對合成C 末端修飾肽存在著先天障礙。選用相對普通的2-氯三苯甲基氯樹脂為載體，固相合成全保護肽亮丙瑞林(Py r-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-eu-A rg-Pro-NHEt)，25 ℃下乙胺化反應(yīng)5 min 后直接切割側(cè)鏈，實現(xiàn)了肽片段乙胺化和側(cè)鏈切割步驟的連續(xù)耦合進(jìn)行，避免了中間產(chǎn)物的分離純化，成功為其他C-末端多肽修飾提供借鑒。

3）酶法

酶在修飾位點的立體選擇性和溫和快速高效的合成反應(yīng)條件等方面具有極大的優(yōu)勢。在糖肽合成中，糖基氨基酸經(jīng)酶促縮合反應(yīng)接入寡肽，然后用糖基轉(zhuǎn)移酶完成進(jìn)一步的寡糖修飾，這種酶促反應(yīng)可以在水溶液中進(jìn)行，并且只需要最小限度的保護。但是酶存在著來源單一，不易獲取等局限性。此外底物中肽鏈氨基酸順序有可能會影響其修飾效率，以酶法將半乳糖胺連接到肽段上合成糖肽時，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)的產(chǎn)率取決于底物的結(jié)構(gòu)和糖基化兩個因素，普遍較低。隨著DNA 技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，酶將在肽修飾中發(fā)揮越來越重要的作用。

4）化學(xué)酶法耦合

采用化學(xué)和酶法相結(jié)合的化學(xué)酶法來進(jìn)行肽修飾研究，可減少化學(xué)試劑的過量使用帶來的污染，同時也保證了溫和條件下酶催化的產(chǎn)率。固相合成N 端共軛糖基內(nèi)嗎啡肽-1 衍生物，再在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下將N-乙酰基胺基葡糖化合物連接到化學(xué)法合成的糖肽上，形成目標(biāo)產(chǎn)物N端三糖肽內(nèi)嗎啡肽-1 類似物，此合成過程只需最小限度的保護。以修飾的硅膠為固相載體，此載體上用化學(xué)法快速合成肽鍵并酶法合成糖苷鍵，成功合成Sialyl lew is x 抗原。

2.多肽修飾的策略

多肽修飾過程中，通常采用總體縮合策略、單元構(gòu)建策略以及天然化學(xué)連接。針對修飾過程中肽鏈的縮合與不同的修飾化基團的結(jié)構(gòu)之間相互影響，常采用不同的策略。

1）總體縮合策略

總體縮合策略，是指將已制備的多肽鏈與目標(biāo)修飾劑催化結(jié)合，以避免肽鏈延長過程中所用試劑對修飾劑與肽段連接效率的影響。以糖肽為例，在縮合過程中，先分別合成多肽和寡糖，再將多肽受體與寡糖供體縮合形成N-或O-糖肽。此策略可避免肽鏈延長過程中酸性去保護條件對O-糖苷鍵的影響。但是直接糖基化肽鏈中的絲氨酸或蘇氨酸還存在著很大的困難，嘗試了在樹脂上的固相糖基化反應(yīng)，合成采用端基連接烯丙基氨基甲酸酯的乙酰基保護葡萄糖，與樹脂上連有蘇氨酸殘基的三肽發(fā)生反應(yīng)，Pd 催化切除后，發(fā)現(xiàn)以64 %收率回收原料，而產(chǎn)物總收率只有4 %。目前此策略主要應(yīng)用在糖基和天冬酰胺相連的N-鏈接糖肽中。

2）單元構(gòu)建策略

單元構(gòu)建策略是指先制備不同修飾基團的單元，再將逐個單元催化耦合。在糖基化修飾過程中，由于氨基酸與糖之間的糖苷鍵在肽鏈延長之前已形成，位點與立體選擇較易控制，目前已成為合成的常用方法，特別適用于固相合成法和合成含有多個糖基的糖肽。此策略需預(yù)先在液相中合成糖基化氨基酸，已研制出葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、GlcβGlc 、Man 、擬糖物、核糖等與天冬酰胺相連接的構(gòu)建單元。引進(jìn)微波技術(shù)合成Fmoc-L-A sn(GlcA c4)，縮合時間從16 ～ 24h 縮短至5 min(100W ，70 ℃)，極大地方便了N-糖肽的合成。在策略的選擇上，采用Fmoc 固相合成策略研究磷酸化血管緊張素Ⅱ 的合成，選擇N ，N-二乙基-二叔丁氧基亞磷酰胺為磷酸化試劑?？傮w磷酸化法選用側(cè)鏈羥基未保護的酪氨酸作為固相合成的單體進(jìn)行肽的合成。磷酸化單體Fmoc-Tyr(PO3 But2)-OH 為單體進(jìn)行肽的合成。采用總體磷酸化法和磷酸化單體法都得到了所需要的磷酸化血管緊張素Ⅱ 。采用總體法不但能夠得到磷肽，而且也得到了非磷酸化的多肽，但是磷酸化效率低，產(chǎn)率約為17 %，粗品肽較難分離。而單體法提供了更為直接的合成步驟，合成效率更高，副產(chǎn)物較少，而且產(chǎn)率可達(dá)到38 %，因此認(rèn)為合成包含磷酸化酪氨酸的多肽采用磷酸化單體法更好。

3.天然化學(xué)連接

采用固相合成時，往往只能得到得到少于50 個氨基酸的肽修飾物，并且當(dāng)肽鏈上有多個修飾位點，采取以往的策略往往有很多困難。針對這種局限性，發(fā)展了一種有效片段連接方式：天然化學(xué)連接(NCL)。它是指在C 端的肽硫酯和一個N 端未保護的半胱氨酸殘基作用，形成一個天然的半胱氨酸將兩個片段連接起來。選用鏈烷磺胺作為連接手臂來獲取C 端肽硫酯，利用NCL 策略將2 個糖肽片段連接成具有82 個殘基結(jié)構(gòu)的抗菌糖蛋白伏蠅素。在環(huán)肽的合成中應(yīng)用固相多肽合成方法，以Boc/Bzl 策略由C 端向N 端逐步延長肽鏈，得到線性肽硫酯的肽樹脂。經(jīng)裂解、純化的線性肽硫酯，在N aHCO3 水溶液，通過硫內(nèi)酯自發(fā)地經(jīng)過S 原子到N 原子的?；w移而形成環(huán)肽。類型肽修飾物種類繁多，這里主要介紹幾種最主要的肽修飾物的最新研究進(jìn)展。

1）PEG-肽結(jié)合物：目前在肽類化合物的PEG 修飾研究中應(yīng)用最為普遍的是單甲氧基聚乙二醇(mPEG ：CH3O-(CH2-CH2O)n-H)。該修飾先在mPEG 的末端引入羧基、氨基等活性基團，或者制備經(jīng)mPEG 修飾的氨基酸衍生物，再利用固相或液相法將其偶聯(lián)到肽序列中去，從而實現(xiàn)對多肽的N 端、C 端及某些氨基酸側(cè)鏈的聚乙二醇化修飾。研究不同的PEG 相對分子質(zhì)量和不同的連接方式對PEG 化的胰島素的生物活性和耐熱穩(wěn)定性的影響，實驗中選取了相對分子質(zhì)量為1100 、2000 、5000 g/mo l 的三種mPEG ，然后分別經(jīng)過琥珀酸酐(SA)、氰尿酰氯(CC)、對甲苯磺酰氯(TC)活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)修飾后的胰島素的生物活力有所降低，但經(jīng)較高相對分子質(zhì)量的mPEG 修飾的胰島素對酶與底物的結(jié)合位點表現(xiàn)出更大的親和力，耐熱穩(wěn)定性明顯提高，且胰島素經(jīng)過氰尿酰氯活化的CC-mPEG(5000 g/mo l)修飾后具。近年來，隨著PEG 化化學(xué)研究的逐漸深入，異端雙功能基PEG 衍生物在肽化學(xué)上也有了重要應(yīng)用，將PEG 兩端分別進(jìn)行DMT 和Fmo c 保護，其中DMT 端接寡核苷酸鏈，Fmoc 保護端接肽，采用液相法得到寡核苷酸-PEG-肽的結(jié)合物。在PEG 的末端采用固相合成策略成功引入羧基，合成奧曲肽-PEG- DSPE(二十八烷酰磷脂酰乙醇胺(腦磷酯))。雖然合成多肽的PEG 修飾在方法學(xué)上取得了一定的進(jìn)展，但在實際操作中還是存在問題。由于PEG 是一種聚合物，相對分子質(zhì)量不能確定。由于多肽修飾的PEG 相對分子質(zhì)量通常為5000 至20000 ，固相合成法中修飾多肽難度較大，反應(yīng)速率很慢且產(chǎn)率很低。因此可考慮在液相中修飾，但這勢必會增加后處理次數(shù)，對產(chǎn)物的生物活性將造成不利的影響。

2）糖肽

多肽糖基化修飾后的產(chǎn)物稱為糖肽，可作為模型工具在糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)研究上發(fā)揮重要作用。因此，糖肽的合成就顯得尤為重要。目前寡糖和多肽鏈之間的連接鍵主要有C-、N-、O-和S-糖苷鍵，其中N-、O-糖苷鍵應(yīng)用最普遍。糖苷鍵在化學(xué)上的不穩(wěn)定性大大增加了肽合成的復(fù)雜性。糖苷鍵通常會在酸性條件下水解，而且對于所有的糖基絲氨酸和蘇氨酸衍生物，即使是在堿性很弱的條件下，也有發(fā)生β 消除反應(yīng)的可能性。N-連接糖基化可以引入一糖胺，通過酰胺與羧基結(jié)合來保護天冬酰胺，這種方法不需要特別的保護糖或肽，并且可以通過糖胺與多肽鏈中的天冬酰胺殘基結(jié)合而得到N-連接糖肽。在O-連接糖肽的合成中，絲氨酸和蘇氨酸的羥基作為糖基的受體，需要對糖和肽進(jìn)行保護。選擇性地脫除糖基氨基酸或糖肽的保護基，仍是一個很長時間都沒有解決的問題，盡管這個問題早在20 世紀(jì)70 年代末就已經(jīng)提出來了，在不破壞糖苷鍵的條件下，β-糖基氨基酸衍生物的Z 基用HBr/AcO H 不能脫除。盡管在一定條件下脫除Boc 殘基是可以實現(xiàn)的，但在糖肽合成中，酸性條件下的脫保護反應(yīng)仍需先進(jìn)行仔細(xì)的衡量。正如所提及的，對堿敏感的糖基絲氨酸或蘇氨酸衍生物(β 消除反應(yīng))進(jìn)一步限制了脫保護的反應(yīng)范圍。因此，保護基只能在溫和的或中性的反應(yīng)條件下進(jìn)行脫除。

3）磷肽

蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著生命活動的所有過程，包括細(xì)胞的增殖發(fā)育和分化、神經(jīng)活動、肌肉收縮、新陳代謝和腫瘤發(fā)生等，而磷肽則是體現(xiàn)其母體蛋白磷酸化過程結(jié)構(gòu)變化的最好模型。根據(jù)磷酸化氨基酸殘基的不同，可將磷酸化多肽分為四類，即N-磷?；嚯摹?/span>O-磷?；嚯?、?；姿犭暮?/span>S-磷?；嚯?。O-磷酰化多肽是通過羥基氨基酸的磷酸化形成的，如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸、羥脯氨酸或羥賴氨酸磷酸化；N-磷酰化多肽是通過精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成的；?；姿犭氖峭ㄟ^天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的；而S-磷?；嚯膭t通過半胱氨酸磷酸化形成。磷肽合成的常用方法是將合成好的未被磷酸化的多肽與在磷酸激酶的作用下進(jìn)行酶法磷酸化，但是該法對于不能被磷酸激酶磷酸化的多肽并不適用，迄今為止，磷肽及其類似物的化學(xué)合成仍非易事。采用"一鍋"法用三氯氧化磷將L-亮氨酸活化72 h ，然后用1 、4 二氧雜環(huán)乙烷將其冷卻，再加入二異丙氧基亞膦酸酯(DIPPH)和次氯酸鈉(NaClO)，混合后反應(yīng)，得到N-磷酸化同源肽，而異源肽及其磷酸化也正處于研究中。

4）環(huán)肽

較短的線性肽在生物體內(nèi)易被各種生物酶迅速降解，形成環(huán)肽可提高肽的酶和化學(xué)穩(wěn)定性。由于環(huán)肽沒有C 端和N 端，可消除或降低氨肽酶和羧肽酶的降解作用，從而提高了肽的抗酶解能力；同時由于形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，增加了對構(gòu)象的限制性，有可能增加肽與受體的親和力及選擇性，提高活性，減少副作用，是近年來新藥開發(fā)的新方向。環(huán)肽可分為兩類，一類為均環(huán)肽，氨基酸之間均以酰胺鍵相連；另一類為雜環(huán)肽，結(jié)構(gòu)中除酰胺鍵外還有酯鍵、醚鍵、硫酯鍵和二硫鍵等。

A：均環(huán)肽

均環(huán)肽實質(zhì)是形成分子內(nèi)肽鍵的過程，其影響成環(huán)因素是環(huán)的大?。汉邆€氨基酸殘基以上的多肽都能順利成環(huán)，六肽、五肽乃至更小的環(huán)肽合成很困難。選擇從云南繁縷中分離的一個環(huán)五肽(Gly-Ala-Tyr-Leu-A la)為模型肽，以其研制的有機磷化合物DEPBT 為縮合試劑分別用液相法和固相法合成了兩個不同線型肽前體，并仍以DEPBT 作為縮合試劑完成了他們的環(huán)化反應(yīng)，得到了預(yù)期的環(huán)五肽，但是產(chǎn)率只有6 %和6 .5 %，處于很低的水平，并分析得出環(huán)五肽的合成關(guān)鍵在于抑制環(huán)十肽的生成。

B：雜環(huán)肽

雜環(huán)肽的氨基酸殘基之間存在的非酰胺鍵主要是酯鍵和二硫鍵，前者形成過程與酰胺鍵類似，后者合成過程與均環(huán)肽迥異，實質(zhì)為利用氧化劑將兩個Cys 的巰基氧化成-S-S-鍵。目前在多肽二硫鍵的合成過程中，多采用先將含有巰基的還原型多肽從樹脂上裂解下來，再在液相中氧化環(huán)合得到。成環(huán)方法主要有DMSO 法、鐵氰化鉀法、碘氧化法、空氣氧化法和谷胱甘肽氧化法等，而在樹脂上直接氧化成二硫鍵則鮮有文獻(xiàn)報道，以Rink Amide-MBHA 樹脂為載體，采用Fmoc/tBu 正交保護固相合成策略，運用微波照射促進(jìn)，先快速高效地合成得到載有催產(chǎn)素或賴氨加壓素還原型多肽的樹脂，再將連接在樹脂上的各還原型多肽分別在微波促進(jìn)條件下和常溫條件下通過碘氧化法環(huán)合形成二硫鍵制得環(huán)肽。這種合成此類環(huán)肽的方法具有快速高效和純化方便的優(yōu)勢，整個環(huán)肽的合成流程只需數(shù)小時，為此類環(huán)肽的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

主要參考資料

[1] 多肽修飾的pH 敏感脂質(zhì)體研究進(jìn)展

[2] 多肽化學(xué)修飾的研究進(jìn)展