定義

血管生成素（ANG），一種14,124 Da的蛋白質(zhì)，與腫瘤進(jìn)展中的血管生成有關(guān)。它由腫瘤細(xì)胞分泌，腫瘤細(xì)胞是新生血管形成的有效誘導(dǎo)劑1。同時(shí)血管生成素可引起血管收縮并促使血壓升高。它是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一部分，這是降低血壓的藥物的主要靶標(biāo)。血管緊張素（ANG）是血管緊張素原（AGT）在腎素和一系列酶的作用下形成的一組寡肽激素。

血管緊張素是一種肽類(lèi)激素，引起血管收縮及隨后血壓升高。血管緊張素是一種寡肽類(lèi)激素，具有強(qiáng)大的致渴作用。它是由前體分子血管緊張素原生成的，血管緊張素原是肝臟中產(chǎn)生的血清球蛋白。血管緊張素在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中起重要作用(1)。腎素作用于血管緊張素原，產(chǎn)生血管緊張素I。在腎小球旁細(xì)胞中，當(dāng)腎交感神經(jīng)興奮、腎內(nèi)血壓降低或運(yùn)送到致密斑的Na+和Cl-離子降低，致密斑感受到較少的Na+時(shí)，腎小球旁細(xì)胞釋放的腎素增加。腎素裂解血管緊張素原中亮氨酸（Leu）和纈氨酸（Val）之間的肽鍵，生成含有十個(gè)氨基酸的多肽（DES-ASP），即血管緊張素I，血管緊張素I似乎沒(méi)有任何的生物活性，僅僅是作為血管緊張素II的前體。

發(fā)現(xiàn)

1885年，F(xiàn)ett等人首先從由HT-29人結(jié)腸腺癌細(xì)胞1調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中分離血管生成素，然后從正常哺乳動(dòng)物的血漿2和牛奶中分離出血管生成素。隨后已從人，牛，兔，豬和小鼠的血清和牛乳中分離出它。血管生成素具有核糖核酸分解活性，與胰腺RNAse A 具有33％的序列同源性。合成肽'H-Glu-Asn-Gly-Leu-Pro-Val-His-Leu-Asp-Gln-Ser-Ile-Phe-Arg-Arg-OH（108-122）對(duì)應(yīng)于ANG抑制血管生成素的酶和生物活性。幾種C末端合成肽，包括（Ang 108-123），可顯著降低血管生成素誘導(dǎo)的新血管形成。

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Acharya等人在2.4 0 A時(shí)確定了人類(lèi)抗原的晶體結(jié)構(gòu)?？傮w結(jié)構(gòu)具有腎形三級(jí)褶皺，讓人聯(lián)想到RNaseA。核糖核酸裂解活性中心（His-13，His-114和Lys-40）和假定的受體結(jié)合位點(diǎn)，這兩個(gè)關(guān)鍵參與生物學(xué)功能是不同于Rnase A 。  分子的中心核心由帶有一對(duì)反平行扭曲的P結(jié)構(gòu)組成，形成了主拓?fù)?，頂點(diǎn)處有殘基Ser-72和Gly-99。在這些中央鏈的任一側(cè)的兩個(gè)附加鏈（殘基41-47； 111-116）完成了主要的片狀結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)螺旋H1，殘基3-14，H2，殘基22-33和H3，殘基49-58。

作用機(jī)理

ANG四個(gè)方面已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，是必要的ANG誘導(dǎo)的血管生成的過(guò)程中，ANG發(fā)揮其核糖核酸活動(dòng)- ANG有一個(gè)非常弱的10 5 - 10 6比核糖核酸酶答：這更低的核糖核酸活動(dòng)，因?yàn)猷奏そY(jié)合谷氨酰胺（Gln）117殘基“阻礙”了ANG的位點(diǎn)。然而，ANG的核糖核酸分解活性對(duì)于血管生成至關(guān)重要。ANG提神基底膜降解- ANG結(jié)合到一個(gè)上肌動(dòng)蛋白內(nèi)皮細(xì)胞表面 ANG-肌動(dòng)蛋白復(fù)合物從細(xì)胞表面解離并加速組織型纖溶酶原激活物（tPA）催化的纖溶酶從纖溶酶原的生成。ANG-肌動(dòng)蛋白復(fù)合物促進(jìn)基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。該復(fù)合物允許內(nèi)皮細(xì)胞滲透并遷移到血管周組織中?；啄そ到馐茄苌傻幕咎卣?。ANG激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)- ANG結(jié)合至170-kDa的   位于內(nèi)皮細(xì)胞表面上的受體和引發(fā)第二信使系統(tǒng)。ANG與細(xì)胞表面肌動(dòng)蛋白的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞相關(guān)蛋白酶系統(tǒng)的活化，從而促進(jìn)細(xì)胞侵襲。ERK1 / 2，蛋白激酶B / Akt1 已經(jīng)提出通過(guò)ANG刺激來(lái)激活這些途徑。ANG核易位-血管生成素通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和核定位序列輔助的核輸入在內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行核易位。核定位信號(hào)（NLS）位于蛋白質(zhì)的31-RRRGL-35中。核易位后，它增強(qiáng)rRNA轉(zhuǎn)錄。

功能
血管緊張素受體存在于許多組織類(lèi)型中，包括腎上腺皮質(zhì)，腎小球，心臟，下丘腦，肝臟，胰腺，垂體，血小板，腎小管，子宮和血管平滑肌。通過(guò)放射性配體與拮抗劑的結(jié)合已鑒定出兩種高親和力受體亞型：氯沙坦（DuP 753 / MK954）鑒定AT1受體；PD123177和CGP42112A是AT2受體的標(biāo)記。血管緊張素II可能在體液系統(tǒng)外的組織中局部產(chǎn)生。例如，它存在于大腦，腎臟和心臟。在大腦中，七肽血管緊張素（1-7）模仿血管緊張素II的某些作用，但可能直接由血管緊張素I形成。心臟中有非ACE介導(dǎo)的血管緊張素II產(chǎn)生的證據(jù)。血管內(nèi)血管緊張素II受體與血管加壓素和其他垂體后葉激素的中樞釋放，交感神經(jīng)外流增加，口渴反應(yīng)以及可能的認(rèn)知功能有關(guān)。血管緊張素II對(duì)心臟以及對(duì)生長(zhǎng)/肥大的正性和變時(shí)性作用; 控制醛固酮的釋放以及皮質(zhì)醇和醛固酮分泌之間的平衡；并調(diào)節(jié)鈉，氯和碳酸氫鹽在腎臟內(nèi)的運(yùn)輸。

ANG在血管生成中的功能-作為關(guān)鍵的血管生成因子，ANG與內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)多種細(xì)胞應(yīng)答，包括細(xì)胞遷移，侵襲，增殖和腎小管結(jié)構(gòu)形成。還已經(jīng)報(bào)道ANG可直接誘導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖。最近，ANG 基因被確定為潛在的肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）相關(guān)基因6。ANG可誘導(dǎo)多種人類(lèi)癌癥中的腫瘤生長(zhǎng)，包括乳腺癌，宮頸癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，胃癌，肝癌，腎癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和尿路上皮癌，以及星形細(xì)胞瘤，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，骨肉瘤，和腎母細(xì)胞“腫瘤 6。ANG可能與肌萎縮性側(cè)索硬化癥有關(guān)-肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）是一種進(jìn)展性遲發(fā)性神經(jīng)退行性疾病，會(huì)影響上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（MNs）。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是第一個(gè)被證明與ALS 7發(fā)病有關(guān)的血管生成因子。

多肽H2N-Val-Tyr-Ile-His-Pro-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹(shù)脂：稱(chēng)取1.91g CTC Resin（如初始取代度約為0.42mmol/g）和0.96mmol Fmoc-Pro-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時(shí)CTC樹(shù)脂體積會(huì)增大好幾倍，避免DCM溶液過(guò)少），再加入2.41mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時(shí)后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級(jí)甲醇，封端半小時(shí)。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Pro-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹(shù)脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮?dú)?0分鐘，然后2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Pro-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取2.41mmol Fmoc-His(Trt)-OH 氨基酸，加入到上述樹(shù)脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入4.81mmol DIPEA，2.29mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色。用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂。（洗滌樹(shù)脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-His(Trt)-Pro-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹(shù)脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-His(Trt)-Pro-CTC Resin

Fmoc-Ile-His(Trt)-Pro-CTC Resin

H2N-Ile-His(Trt)-Pro-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-His(Trt)-Pro-CTC Resin

H2N-Tyr(tBu)-Ile-His(Trt)-Pro-CTC Resin

Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Ile-His(Trt)-Pro-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專(zhuān)肽生物多肽計(jì)算器-多肽結(jié)構(gòu)計(jì)算器中，一鍵畫(huà)出。

最后再經(jīng)過(guò)步驟二得到 H2N-Val-Tyr(tBu)-Ile-His(Trt)-Pro-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、切割：6倍樹(shù)脂體積的切割液（或每1g樹(shù)脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時(shí)，過(guò)濾掉樹(shù)脂，用冰無(wú)水乙醚沉淀濾液，并用冰無(wú)水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Val-Tyr-Ile-His-Pro-COOH。結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒(méi)有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過(guò)這時(shí)要取小樣復(fù)測(cè)下純度 是否目標(biāo)純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專(zhuān)肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://tsjxdd.com）主營(yíng)定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類(lèi)長(zhǎng)肽，短肽，環(huán)肽，提供各類(lèi)修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書(shū)肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對(duì)或者多對(duì)二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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