Ac-DQMD-AFC, fluorogenic substrate for caspase-3. It contains the DQMD peptide sequence of the baculovirus caspase inhibitor p35.

 Caspase酶對應(yīng)的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依賴性天冬氨酸定向蛋白酶）是一類蛋白酶家族，其功能與凋亡（程序性細(xì)胞死亡），壞死和發(fā)燒（炎癥）的過程密切相關(guān)。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它們是為細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)。多種受體，例如TNF-α 受體，F(xiàn)asL受體，TLR和死亡受體，以及Bcl-2和凋亡抑制劑（IAP）蛋白家族參與并調(diào)節(jié)該caspase依賴性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號（外部或內(nèi)在）刺激被激活，即會參與執(zhí)行下游蛋白底物的水解作用，并觸發(fā)一系列事件，導(dǎo)致細(xì)胞分解，死亡，吞噬作用和細(xì)胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物學(xué)功能等共性主要可分為三大類：第一類由具有長胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的“炎癥”胱天蛋白酶組成，他們對P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類由具有短的前體結(jié)構(gòu)域的“細(xì)胞凋亡效應(yīng)”胱天蛋白酶組成，而第三類由具有長的前提結(jié)構(gòu)域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發(fā)劑”胱天蛋白酶組成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分類：

       啟動器Caspase和效應(yīng)器Caspase酶

      根據(jù)其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用，胱天蛋白酶可分為兩類：啟動器和效應(yīng)器Caspase酶。啟動器和效應(yīng)器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點，Caspase酶的識別位

      凋亡啟動器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以啟動caspase激活級聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8對于形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效應(yīng)子Caspase（例如Caspase 3）并介導(dǎo)線粒體中細(xì)胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對IETD肽序列具有相對較高的底物選擇性。凋亡效應(yīng)胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7雖然不負(fù)責(zé)啟動級聯(lián)途徑，但是當(dāng)被激活時，它們在級聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是關(guān)鍵效應(yīng)器，因為它放大了來自啟動器Caspase的信號，使用對Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對活化的Caspase-3進(jìn)行檢測，可以檢測Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制劑

      Caspase底物和抑制劑由兩個關(guān)鍵成分組成：Caspase識別序列和信號產(chǎn)生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識別序列不同，一般由三個或四個氨基酸組成（表2）。Caspase酶識別序列的N端通常有乙?；ˋc）或碳苯甲氧基（Z）基團(tuán)修飾，以增強膜的通透性。對應(yīng)的Caspase識別特定的肽序列為其酶促反應(yīng)切割位點，釋放產(chǎn)生信號或抑制信號的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信號或顏色強度與蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的顯色底物

      Caspase的顯色底物是有Caspase識別序列及生色基團(tuán)組成，常見的生色團(tuán)有pNA（對硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶標(biāo)儀或分光光度計在405 nm處進(jìn)行光密度檢測。

       表3. Caspase的顯色底物

       Caspase的熒光底物

      Caspase的熒光底物的結(jié)構(gòu)包含與半胱天冬酶識別相關(guān)的熒光團(tuán)，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于兩步裂解過程，其動態(tài)范圍更窄。 建議將R110標(biāo)記的Caspase底物用于終點法測定，而將AMC和AFC標(biāo)記的 Caspase底物用于動力學(xué)測定。

      圖.從左到右，分別是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激發(fā)和發(fā)射光譜。

       表4.熒光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波長處的摩爾消光系數(shù)（單位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率。

       Caspase抑制劑

      Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點結(jié)合并形成可逆或不可逆的連接，通常，Caspase抑制劑的結(jié)構(gòu)由Caspase識別序列，諸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能團(tuán)組成。具有醛官能團(tuán)的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的，而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細(xì)胞毒性作用，因此，它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制劑

定義
酶是用于生化反應(yīng)的非常有效的催化劑。它們通過提供較低活化能的替代反應(yīng)途徑來加快反應(yīng)速度。酶作用于底物并產(chǎn)生產(chǎn)物。一些物質(zhì)降低或什至停止酶的催化活性被稱為抑制劑。
發(fā)現(xiàn)
1965年，Umezawa H分析了微生物產(chǎn)生的酶抑制劑，并分離出了抑制亮肽素和抗痛藥的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，乳糜蛋白酶抑制的胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶抑制素抑制胃蛋白酶，泛磷酰胺抑制唾液酸酶，烏藤酮抑制酪氨酸羥化酶，多巴汀抑制多巴胺3-羥硫基嘧啶和多巴胺3-羥色胺酶酪氨酸羥化酶和多巴胺J3-羥化酶。最近，一種替代方法已應(yīng)用于預(yù)測新的抑制劑：合理的藥物設(shè)計使用酶活性位點的三維結(jié)構(gòu)來預(yù)測哪些分子可能是抑制劑1。已經(jīng)開發(fā)了用于識別酶抑制劑的基于計算機的方法，例如分子力學(xué)和分子對接。
結(jié)構(gòu)特征
已經(jīng)確定了許多抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)。已經(jīng)確定了三種與凝血酶復(fù)合的高效且選擇性的低分子量剛性肽醛醛抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)。這三種抑制劑全部在P3位置具有一個新的內(nèi)酰胺部分，而對胰蛋白酶選擇性最高的兩種抑制劑在P1位置具有一個與S1特異性位點結(jié)合的胍基哌啶基。凝血酶的抑制動力學(xué)從慢到快變化，而對于胰蛋白酶，抑制的動力學(xué)在所有情況下都快。根據(jù)兩步機理2中穩(wěn)定過渡態(tài)絡(luò)合物的緩慢形成來檢驗動力學(xué)。
埃米爾•菲舍爾（Emil Fischer）在1894年提出，酶和底物都具有特定的互補幾何形狀，彼此恰好契合。這稱為“鎖和鑰匙”模型3。丹尼爾·科什蘭（Daniel Koshland）提出了誘導(dǎo)擬合模型，其中底物和酶是相當(dāng)靈活的結(jié)構(gòu)，當(dāng)?shù)孜锱c酶4相互作用時，活性位點通過與底物的相互作用不斷重塑。
在眾多生物活性肽的成熟過程中，需要由其谷氨酰胺（或谷氨酰胺）前體形成N末端焦谷氨酸（pGlu）。游離形式并與底物和三種咪唑衍生抑制劑結(jié)合的人QC的結(jié)構(gòu)揭示了類似于兩個鋅外肽酶的α/β支架，但有多個插入和缺失，特別是在活性位點區(qū)域。幾種活性位點突變酶的結(jié)構(gòu)分析為針對QC相關(guān)疾病5的抑制劑的合理設(shè)計提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
作用方式
酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。酶與底物相互作用并將其轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。抑制劑的結(jié)合可以阻止底物進(jìn)入酶的活性位點和/或阻止酶催化其反應(yīng)。抑制劑的種類繁多，包括：非特異性，不可逆，可逆-競爭性和非競爭性?？赡嬉种苿?nbsp;以非共價相互作用（例如疏水相互作用，氫鍵和離子鍵）與酶結(jié)合。非特異性抑制方法包括最終使酶的蛋白質(zhì)部分變性并因此不可逆的任何物理或化學(xué)變化。特定抑制劑 對單一酶發(fā)揮作用。大多數(shù)毒藥通過特異性抑制酶發(fā)揮作用。競爭性抑制劑是任何與底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子幾何結(jié)構(gòu)非常相似的化合物。抑制劑可以在活性位點與酶相互作用，但是沒有反應(yīng)發(fā)生。非競爭性抑制劑是與酶相互作用但通常不在活性位點相互作用的物質(zhì)。非競爭性抑制劑的凈作用是改變酶的形狀，從而改變活性位點，從而使底物不再能與酶相互作用而產(chǎn)生反應(yīng)。非競爭性抑制劑通常是可逆的。不可逆抑制劑與酶形成牢固的共價鍵。這些抑制劑可以在活性位點附近或附近起作用。
功能
工業(yè)應(yīng)用中， 酶在商業(yè)上被廣泛使用，例如在洗滌劑，食品和釀造工業(yè)中。蛋白酶用于“生物”洗衣粉中，以加速蛋白質(zhì)在諸如血液和雞蛋等污漬中的分解。商業(yè)上使用酶的問題包括：它們是水溶性的，這使得它們難以回收，并且一些產(chǎn)物可以抑制酶的活性（反饋抑制）。
藥物分子，許多藥物分子都是酶抑制劑，藥用酶抑制劑通常以其特異性和效力為特征。高度的特異性和效力表明該藥物具有較少的副作用和較低的毒性。酶抑制劑在自然界中發(fā)現(xiàn)，并且也作為藥理學(xué)和生物化學(xué)的一部分進(jìn)行設(shè)計和生產(chǎn)6。
天然毒物 通常是酶抑制劑，已進(jìn)化為保護(hù)植物或動物免受天敵的侵害。這些天然毒素包括一些已知最劇毒的化合物。
神經(jīng)氣體（ 例如二異丙基氟磷酸酯（DFP））通過與絲氨酸的羥基反應(yīng)生成酯，從而抑制了乙酰膽堿酯酶的活性位點。
參考
1、Scapin G (2006). Structural biology and drug discovery. Curr. Pharm. Des.,      12(17):2087–2097.
2、Krishnan R, Zhang E, Hakansson K, Arni RK, Tulinsky A, Lim-Wilby MS, Levy OE, Semple JE, Brunck TK (1998). Highly selective mechanism-based thrombin inhibitors:  structures of thrombin and trypsin inhibited with rigid peptidyl aldehydes. Biochemistry, 37 (35):12094-12103.
3、Fischer E (1894). Einfluss der configuration auf die wirkung der enzyme. Ber. Dt. Chem. Ges., 27:2985–2993.
4、Koshland DE (1958). Application of a theory of enzyme specificity to protein synthesis. PNAS., 44 (2):98–104.
5、Huang KF, Liu YL, Cheng WJ, Ko TP, Wang AH (2005). Crystal structures of human glutaminyl cyclase, an enzyme responsible for protein N-terminal pyroglutamate formation. PNAS., 102(37):13117-13122.
6、Holmes CF, Maynes JT, Perreault KR, Dawson JF, James MN (2002). Molecular enzymology underlying regulation of protein phosphatase-1 by natural toxins. Curr Med Chem., 9(22):1981-1989.

Definition
Enzymes are very efficient catalysts for biochemical reactions. They speed up reactions by providing an alternative reaction pathway of lower activation energy. Enzyme acts on substrate and gives rise to a product. Some substances reduce or even stop the catalytic activities of enzymes are called inhibitors.

Discovery
In 1965, Umezawa H analysed enzyme inhibitors produced by microorganisms and isolated leupeptin and antipain inhibiting trypsin and papain, chymostatin inhibiting chymotrypsin, pepstatin inhibiting pepsin, panosialin inhibiting sialidases, oudenone inhibiting tyrosine hydroxylase, dopastin inhibiting dopamine 3-hydroxylase, aquayamycin and chrothiomycin inhibiting tyrosine hydroxylase and dopamine J3-hydroxylase . Recently, an alternative approach has been applied to predict new inhibitors: rational drug design uses the three-dimensional structure of an enzyme's active site to predict which molecules might be inhibitors 1. Computer-based methods for identifying inhibitor for an enzyme have been developed, such as molecular mechanics and molecular docking.

Structural Characteristics
The crystal structures of many inhibitors have been determined. The crystal structures of three highly potent and selective low-molecular weight rigid peptidyl aldehyde inhibitors complexed with thrombin have been determined. All the three inhibitors have a novel lactam moiety at the P3 position, while the two with greatest trypsin selectivity have a guanidinopiperidyl group at the P1 position that binds in the S1 specificity site. The kinetics of inhibition vary from slow to fast with thrombin and are fast in all cases with trypsin. The kinetics are examined in terms of the slow formation of a stable transition-state complex in a two-step mechanism 2.

Emil Fischer in 1894 suggested that both the enzyme and the substrate possess specific complementary geometric shapes that fit exactly into one another.This is known as "the lock and key" model 3. Daniel Koshland suggested induced fit model where substrate and enzymes are rather flexible structures, the active site is continually reshaped by interactions with the substrate as the substrate interacts with the enzyme 4.

N-terminal pyroglutamate (pGlu) formation from its glutaminyl (or glutamyl) precursor is required in the maturation of numerous bioactive peptides. The structure of human QC in free form and bound to a substrate and three imidazole-derived inhibitors reveals an alpha/beta scaffold akin to that of two-zinc exopeptidases but with several insertions and deletions, particularly in the active-site region. The structural analyses of several active-site-mutant enzymes provide a structural basis for the rational design of inhibitors against QC-associated disorders 5.

Mode of Action
Enzymes are proteins that catalyze chemical reactions. Enzymes interact with substrate and convert them into products. Inhibitor binding can stop a substrate from entering the enzyme's active site and/or hinder the enzyme from catalyzing its reaction. There are a variety of types of inhibitors including: nonspecific, irreversible, reversible - competitive and noncompetitive. Reversible inhibitors bind to enzymes with non-covalent interactions like hydrophobic interactions, hydrogen bonds, and ionic bonds. Non-specific methods of inhibition include any physical or chemical changes which ultimately denature the protein portion of the enzyme and are therefore irreversible. Specific Inhibitors exert their effects upon a single enzyme. Most poisons work by specific inhibition of enzymes. A competitive inhibitor is any compound which closely resembles the chemical structure and molecular geometry of the substrate. The inhibitor may interact with the enzyme at the active site, but no reaction takes place. A noncompetitive inhibitor is a substance that interacts with the enzyme, but usually not at the active site.  The net effect of a non competitive inhibitor is to change the shape of the enzyme and thus the active site, so that the substrate can no longer interact with the enzyme to give a reaction. Non competitive inhibitors are usually reversible. Irreversible Inhibitors form strong covalent bonds with an enzyme.  These inhibitors may act at, near, or remote from the active site .

Functions
Industrial application, enzymes are widely used commercially, for example in the detergent, food and brewing industries. Protease enzymes are used in 'biological' washing powders to speed up the breakdown of proteins in stains like blood and egg. Problems using enzymes commercially include: they are water soluble which makes them hard to recover and some products can inhibit the enzyme activity (feedback inhibition) .

Drug molecules, many drug molecules are enzyme inhibitors and a medicinal enzyme inhibitor is usually characterized by its specificity and its potency. A high specificity and potency suggests that a drug will have fewer side effects and less toxic. Enzyme inhibitors are found in nature and are also designed and produced as part of pharmacology and biochemistry 6.

Natural poisons are often enzyme inhibitors that have evolved to defend a plant or animal against predators. These natural toxins include some of the most poisonous compounds known.

Nerve gases such as diisopropylfluorophosphate (DFP) inhibit the active site of acetylcholine esterase by reacting with the hydroxyl group of serine to make an ester.

References

Scapin G (2006). Structural biology and drug discovery. Curr. Pharm. Des.,      12(17):2087–2097.

Krishnan R, Zhang E, Hakansson K, Arni RK, Tulinsky A, Lim-Wilby MS, Levy OE, Semple JE, Brunck TK (1998). Highly selective mechanism-based thrombin inhibitors:  structures of thrombin and trypsin inhibited with rigid peptidyl aldehydes. Biochemistry, 37 (35):12094-12103.

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Holmes CF, Maynes JT, Perreault KR, Dawson JF, James MN (2002). Molecular enzymology underlying regulation of protein phosphatase-1 by natural toxins. Curr Med Chem., 9(22):1981-1989.

多肽熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學(xué)研究中多肽熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，多肽熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的多肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免在切割的過程中被TFA切割掉。
        人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來檢測目標(biāo)蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        專肽生物能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。
 

下面是一些常見的多肽修飾熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)：




FITC標(biāo)記

      FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標(biāo)記于多肽 上：(1) 將FITC標(biāo)記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護(hù)的鳥氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基 上；(2) 將FITC標(biāo)記于多肽N端氨基。

      當(dāng)在N端標(biāo)記時，建議在最后一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入 烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC 的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器 如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免?？臻g位阻 被認(rèn)為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標(biāo)記的多肽上。

普通熒光修飾

通過Lys側(cè)鏈氨基連接的熒光修飾

專肽常做的熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長?？晒﹨⒖歼x擇：

定義
細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡是多細(xì)胞生物發(fā)育和健康的正常組成部分。細(xì)胞響應(yīng)各種刺激而死亡，在細(xì)胞凋亡期間，它們以受控，受控的方式死亡。

發(fā)現(xiàn)
1885年， Flemming W描述了程序性細(xì)胞死亡的過程。約翰·克爾（John Kerr）在1960年代后期的發(fā)現(xiàn)最初被稱為“收縮壞死”，但后來改名為“細(xì)胞凋亡”，是在他對大鼠急性肝損傷的研究中，他的注意力被好奇的肝細(xì)胞死亡形式引起的 ^1,2。  1972年，Kerr提出了術(shù)語“細(xì)胞凋亡”的意思是控制細(xì)胞缺失的機制，它似乎在調(diào)節(jié)動物細(xì)胞群中與有絲分裂起著互補但相反的作用。它的形態(tài)學(xué)特征表明它是一種活躍的，固有編程的現(xiàn)象，并且已經(jīng)表明它可以被多種環(huán)境刺激所引發(fā)或抑制， ³。 

結(jié)構(gòu)特征
Bcl-2家族成員之間的異二聚化是調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵事件。通過確定存活蛋白Bcl-xL和Bcl-2相關(guān)蛋白Bak的促死亡區(qū)域之間的復(fù)合物的溶液結(jié)構(gòu)，研究了異二聚體形成的分子基礎(chǔ)。突變型Bak肽的結(jié)構(gòu)和結(jié)合親和力表明Bak肽采用兩親性螺旋，通過疏水和靜電相互作用與Bcl-xL相互作用。全長Bak的突變會破壞任一類型的相互作用，從而抑制Bak與Bcl-xL ⁴異源二聚的能力。

通過核磁共振波譜（NMR）確定與Bcl-xL具有生物活性的缺失突變體復(fù)合的16-氨基酸肽的結(jié)構(gòu)。由總共2813個NMR約束確定結(jié)構(gòu)，并通過NMR數(shù)據(jù)很好地定義了結(jié)構(gòu)。當(dāng)與Bcl-xL復(fù)合時，Bak肽形成螺旋。Bak肽的COOH末端部分主要與BH2和BH3區(qū)的殘基相互作用。黑色素瘤細(xì)胞凋亡抑制劑（ML-IAP）是一種有效的抗凋亡蛋白，在許多黑色素瘤細(xì)胞系中上調(diào)，但在大多數(shù)正常成人組織中均未表達(dá)。在人類癌癥中，IAP蛋白（例如ML-IAP或普遍表達(dá)的X染色體連接的IAP（XIAP））的過表達(dá)已顯示可抑制多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。⁵。

作用方式
一旦收到指示細(xì)胞進(jìn)行凋亡的特定信號，細(xì)胞中就會發(fā)生許多明顯的變化。稱為胱天蛋白酶的蛋白質(zhì)家族通常在凋亡的早期被激活。這些蛋白質(zhì)分解或切割正常細(xì)胞功能所需的關(guān)鍵細(xì)胞成分，包括細(xì)胞骨架中的結(jié)構(gòu)蛋白和核蛋白（例如DNA修復(fù)酶）。半胱天冬酶還可以活化其他降解酶，例如DNase，其開始切割細(xì)胞核中的DNA。

凋亡細(xì)胞在凋亡過程中表現(xiàn)出獨特的形態(tài)。通常，在細(xì)胞骨架中的lamins和肌動蛋白絲分裂后，細(xì)胞開始收縮。染色質(zhì)在細(xì)胞核中的分解通常會導(dǎo)致核濃縮，并且在許多情況下，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈“馬蹄形”的外觀。細(xì)胞繼續(xù)收縮，將自身包裝成可被巨噬細(xì)胞去除的形式。有許多機制可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞對這些刺激中任何一種的敏感性可能會因多種因素而異，例如促凋亡和抗凋亡蛋白（例如Bcl-2蛋白或凋亡蛋白的抑制劑）的表達(dá)，刺激的嚴(yán)重程度和細(xì)胞周期的階段。Bcl-2蛋白家族在調(diào)節(jié)多種刺激誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞死亡中起著核心作用。該家族中的某些蛋白質(zhì)，包括Bcl-2和Bcl-xL，可以抑制程序性細(xì)胞死亡，而其他蛋白質(zhì)，例如Bax和Bak，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡 ^6、7。

功能

對于發(fā)育，細(xì)胞凋亡與有絲分裂一樣是正常發(fā)育所必需的。例子：tail變尾時into的吸收被青蛙吸收。

生物體的完整性需要凋亡來破壞對生物體完整性構(gòu)成威脅的細(xì)胞。例子：感染了病毒的細(xì)胞⁸。

免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，一種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)減弱，必須去除效應(yīng)細(xì)胞以防止它們攻擊機體成分。CTLs互相誘導(dǎo)凋亡，甚至自身誘導(dǎo)凋亡⁹。

具有DNA損傷，破壞其基因組的細(xì)胞會導(dǎo)致細(xì)胞破壞正常的胚胎發(fā)育，導(dǎo)致先天缺陷變成癌。

參考

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2.     Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR (1972). Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer., 26(4):239-257.

3.     O'Rourke MG, Ellem KA (2000). John Kerr and apoptosis. Med. J. Aust., 173(11-12): 616-617.

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5.     Sattler M, Liang H, Nettesheim D, Meadows RP, Harlan JE, Eberstadt M, Yoon HS, Shuker SB, Chang BS, Minn AJ, Thompson CB, Fesik SW (1997). Structure of bcl-xl-bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science, 275(5302):983-986.

6.     Hanada M, Aimé-Sempé C, Sato T, Reed JC (1995). Structure-function analysis of Bcl-2 protein. Identification of conserved domains important for homodimerization with Bcl-2 and heterodimerization with Bax. J. Biol. Chem., 270(20):11962-11969.

7.     Cheng EHY, Levine B, Boise LH, Thompson CB, Hardwic JM (1996). Bax-independent inhibition of apoptosis by Bcl-xL.Nature, 379:554-556.

8.     Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR (2003). Mechanisms of CD4+ T lymphocyte cell death in human immunodeficiency virus infection and AIDS. J Gen Virology., 84(84): 1649-1661.

9.     Werlen G, Hausmann B, Naeher D, Palmer E (2003). Signaling life and death in the thymus: timing is everything. Science. 299(5614):1859-1863.

多肽Cbz-Asp-Gln-Met-Asp-AFC的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取1.42g CTC Resin（如初始取代度約為1.04mmol/g）和1.77mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入4.43mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Asp(OtBu)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取4.43mmol Fmoc-Met-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入8.86mmol DIPEA，4.21mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Met-Asp(OtBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Met-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Met-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-Met-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Met-Asp(OtBu)-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結(jié)構(gòu)計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Met-Asp(OtBu)-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、苯甲氧羰酰琥珀酰亞胺Cbz-Cl反應(yīng)連接：在上述樹脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入4.43mmol 苯甲氧羰酰琥珀酰亞胺Cbz-Cl到樹脂中，再加入8.86mmol DIPEA、4.21mmol HBTU，鼓氮氣反應(yīng)30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到Cbz-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Met-Asp(OtBu)-CTC Resin。 結(jié)構(gòu)如下：

6、全保護(hù)切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液體積約為樹脂體積的3倍。再次用DCM洗滌樹脂2遍（去除殘留DMF），后將配置好的溶液倒入到反應(yīng)器中，反應(yīng)30分鐘。抽濾樹脂，收集濾液（此時多肽已經(jīng)從樹脂上分離，存在于濾液中）。多肽序列為 Cbz-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Met-Asp(OtBu)-CTC Resin。 在濾液中添加DIEPA，調(diào)PH至7-8。用飽和NaHCO3洗滌濾液，分離出DCM層溶液。可適當(dāng)旋蒸DCM層溶液，減少有機溶劑。再次加入1或2倍體積的乙酸乙酯，用稀HCl溶液調(diào)PH至微酸性，將多肽從DCM層萃取到乙酸乙酯層。用飽和NaCl洗滌2次乙酸乙酯層。用無水硫酸鎂吸收乙酸乙酯層的水分。通過減壓旋蒸，直接將乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶體狀固體多肽，用于下一步C端反應(yīng)?；蛲ㄟ^減壓旋蒸保留適量乙酸乙酯的溶液體積，加入冰乙醚析出 多肽，然后對多肽進(jìn)行烘干操作即可用于下一步C端反應(yīng)。Cbz-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Met-Asp(OtBu)-COOH的結(jié)構(gòu)圖如下。

7、7-氨基-4-三氟甲基香豆素反應(yīng)連接：在上述樹脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入4.43mmol 7-氨基-4-三氟甲基香豆素到樹脂中，再加入8.86mmol DIPEA、4.21mmol HBTU，鼓氮氣反應(yīng)30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到 Cbz-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Met-Asp(OtBu)-AFC。 結(jié)構(gòu)如下：

8、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品Cbz-Asp-Gln-Met-Asp-AFC。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

9、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復(fù)測下純度 是否目標(biāo)純度。

10、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://tsjxdd.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

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