多肽熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡單。因此，目前在生物學(xué)研究中多肽熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛，多肽熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會(huì)伴有最后一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的多肽從樹脂上切下來時(shí)，這種情況可避免在切割的過程中被TFA切割掉。
        人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來檢測目標(biāo)蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        專肽生物能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。
 

下面是一些常見的多肽修飾熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)：




FITC標(biāo)記
 

      FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標(biāo)記于多肽 上：(1) 將FITC標(biāo)記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護(hù)的鳥氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基 上；(2) 將FITC標(biāo)記于多肽N端氨基。

      當(dāng)在N端標(biāo)記時(shí)，建議在最后一個(gè)氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入 烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC 的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會(huì)伴有最后一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)間隔器 如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時(shí)，這種情況可避免。空間位阻 被認(rèn)為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標(biāo)記的多肽上。

普通熒光修飾

通過Lys側(cè)鏈氨基連接的熒光修飾

專肽常做的熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長?？晒﹨⒖歼x擇：
 

Ac-ED(edans)KPILFFRLGK(dabcyl)E-amide, a sensitive fluorescent (FRET) peptide substrate for cathepsin D. This enzyme can degrade extracellular matrix components and may facilitate the spread of tumor cells. High levels of active cathepsin D were found within senile plaques in brains of Alzheimer's patients.

多肽Ac-Glu-Asp(Edans)-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu-NH2的合成步驟：

1、合成MBHA樹脂：取若干克MBHA樹脂（如初始取代度為0.5mmol/g）和1倍樹脂摩爾量的Fmoc-Linker-OH加入到反應(yīng)器中，加入DMF，攪拌使氨基酸完全溶解。再加入樹脂2倍量的DIEPA，攪拌混合均勻。再加入樹脂0.95倍量的HBTU，攪拌混合均勻。反應(yīng)3-4小時(shí)后，用DMF洗滌3次。用2倍樹脂體積的10%乙酸酐/DMF 進(jìn)行封端30分鐘。然后再用DMF洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，再用甲醇洗滌2次。真空干燥12小時(shí)以上，得到干燥的樹脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，測定取代度。這里測得取代度為 0.3mmol/g。結(jié)構(gòu)如下圖：

2、脫Fmoc：取2.97g的上述樹脂，用DCM或DMF溶脹20分鐘。用DMF洗滌2遍。加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮?dú)?0分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取2.67mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入5.35mmol DIPEA，2.54mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asp(Edans)-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

H2N-Asp(Edans)-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Asp(Edans)-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計(jì)算器-多肽結(jié)構(gòu)計(jì)算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Glu(OtBu)-Asp(Edans)-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHA Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、乙酸酐反應(yīng)連接：在上述樹脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入2.67mmol乙酸酐到樹脂中，再加入5.35mmol DIPEA，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到Ac-Glu(OtBu)-Asp(Edans)-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu(OtBu)-Linker-MBHAResin。 結(jié)構(gòu)如下：

6、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時(shí)，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品Ac-Glu-Asp(Edans)-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Gly-Lys(Dabcyl)-Glu-NH2。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

7、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時(shí)要取小樣復(fù)測下純度 是否目標(biāo)純度。

8、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://tsjxdd.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

以上所有內(nèi)容，為專肽生物原創(chuàng)內(nèi)容，請勿發(fā)布到其他網(wǎng)站上。