Caspase酶對(duì)應(yīng)的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依賴(lài)性天冬氨酸定向蛋白酶）是一類(lèi)蛋白酶家族，其功能與凋亡（程序性細(xì)胞死亡），壞死和發(fā)燒（炎癥）的過(guò)程密切相關(guān)。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它們是為細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)。多種受體，例如TNF-α 受體，F(xiàn)asL受體，TLR和死亡受體，以及Bcl-2和凋亡抑制劑（IAP）蛋白家族參與并調(diào)節(jié)該caspase依賴(lài)性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號(hào)（外部或內(nèi)在）刺激被激活，即會(huì)參與執(zhí)行下游蛋白底物的水解作用，并觸發(fā)一系列事件，導(dǎo)致細(xì)胞分解，死亡，吞噬作用和細(xì)胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物學(xué)功能等共性主要可分為三大類(lèi)：第一類(lèi)由具有長(zhǎng)胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的“炎癥”胱天蛋白酶組成，他們對(duì)P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類(lèi)由具有短的前體結(jié)構(gòu)域的“細(xì)胞凋亡效應(yīng)”胱天蛋白酶組成，而第三類(lèi)由具有長(zhǎng)的前提結(jié)構(gòu)域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發(fā)劑”胱天蛋白酶組成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分類(lèi)：

       啟動(dòng)器Caspase和效應(yīng)器Caspase酶

      根據(jù)其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用，胱天蛋白酶可分為兩類(lèi)：?jiǎn)?dòng)器和效應(yīng)器Caspase酶。啟動(dòng)器和效應(yīng)器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點(diǎn)，Caspase酶的識(shí)別位

      凋亡啟動(dòng)器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以啟動(dòng)caspase激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8對(duì)于形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效應(yīng)子Caspase（例如Caspase 3）并介導(dǎo)線粒體中細(xì)胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對(duì)IETD肽序列具有相對(duì)較高的底物選擇性。凋亡效應(yīng)胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7雖然不負(fù)責(zé)啟動(dòng)級(jí)聯(lián)途徑，但是當(dāng)被激活時(shí)，它們?cè)诩?jí)聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是關(guān)鍵效應(yīng)器，因?yàn)樗糯罅藖?lái)自啟動(dòng)器Caspase的信號(hào)，使用對(duì)Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對(duì)活化的Caspase-3進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制劑

      Caspase底物和抑制劑由兩個(gè)關(guān)鍵成分組成：Caspase識(shí)別序列和信號(hào)產(chǎn)生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識(shí)別序列不同，一般由三個(gè)或四個(gè)氨基酸組成（表2）。Caspase酶識(shí)別序列的N端通常有乙?；ˋc）或碳苯甲氧基（Z）基團(tuán)修飾，以增強(qiáng)膜的通透性。對(duì)應(yīng)的Caspase識(shí)別特定的肽序列為其酶促反應(yīng)切割位點(diǎn)，釋放產(chǎn)生信號(hào)或抑制信號(hào)的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信號(hào)或顏色強(qiáng)度與蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的顯色底物

      Caspase的顯色底物是有Caspase識(shí)別序列及生色基團(tuán)組成，常見(jiàn)的生色團(tuán)有pNA（對(duì)硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)在405 nm處進(jìn)行光密度檢測(cè)。

       表3. Caspase的顯色底物

       Caspase的熒光底物

      Caspase的熒光底物的結(jié)構(gòu)包含與半胱天冬酶識(shí)別相關(guān)的熒光團(tuán)，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于兩步裂解過(guò)程，其動(dòng)態(tài)范圍更窄。 建議將R110標(biāo)記的Caspase底物用于終點(diǎn)法測(cè)定，而將AMC和AFC標(biāo)記的 Caspase底物用于動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

      圖.從左到右，分別是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激發(fā)和發(fā)射光譜。

       表4.熒光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波長(zhǎng)處的摩爾消光系數(shù)（單位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率。

       Caspase抑制劑

      Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點(diǎn)結(jié)合并形成可逆或不可逆的連接，通常，Caspase抑制劑的結(jié)構(gòu)由Caspase識(shí)別序列，諸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能團(tuán)組成。具有醛官能團(tuán)的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的，而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細(xì)胞毒性作用，因此，它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制劑

Abz-FR-K(Dnp)-P-OH 是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 (ACE) 的底物，是一種用于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的內(nèi)猝滅熒光底物。
Abz-FR-K(Dnp)-P-OH is an angiotensin I-converting enzyme (ACE) substrate and an internally quenched fluorogenic substrate for real time fluorescent assay[1].

多肽Abz-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Pro-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹(shù)脂：稱(chēng)取0.94g CTC Resin（如初始取代度約為0.34mmol/g）和0.38mmol Fmoc-Pro-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時(shí)CTC樹(shù)脂體積會(huì)增大好幾倍，避免DCM溶液過(guò)少），再加入0.96mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時(shí)后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級(jí)甲醇，封端半小時(shí)。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Pro-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹(shù)脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮?dú)?0分鐘，然后2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Pro-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取0.96mmol Fmoc-Lys(Dnp)-OH 氨基酸，加入到上述樹(shù)脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入1.92mmol DIPEA，0.91mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色。用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂。（洗滌樹(shù)脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Lys(Dnp)-Pro-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹(shù)脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Lys(Dnp)-Pro-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Dnp)-Pro-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Lys(Dnp)-Pro-CTC Resin

Fmoc-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Dnp)-Pro-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專(zhuān)肽生物多肽計(jì)算器-多肽結(jié)構(gòu)計(jì)算器中，一鍵畫(huà)出。

最后再經(jīng)過(guò)步驟二得到 H2N-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Dnp)-Pro-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、鄰氨基苯甲酸反應(yīng)連接：在上述樹(shù)脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入0.96mmol 鄰氨基苯甲酸到樹(shù)脂中，再加入1.92mmol DIPEA、0.91mmol HBTU，鼓氮?dú)夥磻?yīng)30分鐘。用2倍樹(shù)脂體積的DMF 洗滌3次樹(shù)脂（洗滌樹(shù)脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到Abz-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Dnp)-Pro-CTCResin。 結(jié)構(gòu)如下：

6、切割：6倍樹(shù)脂體積的切割液（或每1g樹(shù)脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時(shí)，過(guò)濾掉樹(shù)脂，用冰無(wú)水乙醚沉淀濾液，并用冰無(wú)水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品Abz-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Pro-COOH。結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒(méi)有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過(guò)這時(shí)要取小樣復(fù)測(cè)下純度 是否目標(biāo)純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專(zhuān)肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE http://tsjxdd.com）主營(yíng)定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類(lèi)長(zhǎng)肽，短肽，環(huán)肽，提供各類(lèi)修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書(shū)肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對(duì)或者多對(duì)二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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