Cell Discovery | 胡家志課題組開發(fā)出優(yōu)化基因編輯和追蹤DNA修復的新方法
2019年3月26號，北京大學生命科學學院和北大-清華生命科學聯(lián)合中心胡家志課題組在Cell Discovery上發(fā)表題為Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing的論文。該研究描述了一種新的方法，可以用來同時定量檢測Cas9編輯效率和脫靶活性以及編輯引起的染色體異常結構，即primer-extension-mediated sequencing（PEM-seq）。這是對基因編輯和DNA損傷修復等領域都有巨大促進作用的新技術。
CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)是目前最常用的基因編輯工具酶，在科研領域被廣泛應用，而在臨床方面的應用因為其脫靶活性一度停滯不前。它通過guide RNA（gRNA）與靶向DNA序列的配對，從而將Cas9錨定在靶向基因并誘導產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB）。在基因編輯誘發(fā)的DSB的修復過程中，一定幾率會產(chǎn)生基因突變或者外源DNA片段的插入，從而達到基因編輯的目的。在實際應用過程中，一個好的基因編輯酶Cas9需要同時滿足高效切割靶位點、低脫靶活性和低染色體異常三個特點。目前在這三個方面，有一部分基于PCR的方法用于估算基因編輯效率，但其結果可靠性有待提高；有一些基于高通量測序的方法可以在體內(nèi)或者體外檢測基因編輯酶的脫靶活性；尚無系統(tǒng)的可定量的測量基因組異常結構的方法。
依據(jù)DNA雙鏈斷裂與染色體易位的原理，胡家志課題組在已有的高通量測序方法(Hu et al., Nature Protocols 2016)的基礎上開發(fā)了靈敏度更高且可以全面且定量評估基因編輯的新方法PEM-seq。與以往基于二代測序評估Cas9脫靶活性的方法相比，PEM-seq不僅可以靈敏的找出Cas9的脫靶位點，還可以精確定量CRISPR/Cas9在靶向位點的切割效率，從而找到更加高效安全的Cas9切割位點。與此同時，PEM-seq還深度揭示了靶向位點附近由于基因編輯而產(chǎn)生的染色體異常結構，例如大片段缺失、染色體易位等。以靶向治療RAG1基因上的RAG1A編輯位點為例，胡家志課題組發(fā)現(xiàn)：在Cas9切割位點5kb以內(nèi)存在著占總編輯事件2.5%的大量的染色體缺失倒位等異常結構；更為嚴重的是，這些異常結構可以延伸至距離切割位點50kb甚至更長的領域，足以嚴重威脅基因組的穩(wěn)定性。這些現(xiàn)象揭示了Cas9應用前評估的必要性。應用PEM-seq可以全面地評估Cas9的切割效率及其所導致的大多異常結構，從而優(yōu)化基因編輯策略，以達到獲得最大編輯效率且盡量減少脫靶活性的效果。
同時，為了降低CRISPR/Cas9的脫靶活性，胡家志課題組將現(xiàn)有Cas9變體的突變位點進行了組合篩選，通過PEM-seq篩選出了一個切割效率與野生型Cas9相當?shù)摪蓄l率明顯更低的變體FeCas9。該酶的使用方法與傳統(tǒng)Cas9類似。
此外，PEM-seq在基因組的穩(wěn)定性研究方面還有較大的潛力?；蚪M的修復與DNA修復等因素密切相關，而傳統(tǒng)的方法多用PCR或者分子克隆獲得修復信息，樣本小且存在偏好性。PEM-seq與一些之前的高通量測序方法類似，可以提供較大的數(shù)據(jù)量，且相對而言有一個更加明顯的優(yōu)勢，即定量。PEM-seq可以對DNA修復的步驟進行逐步定量，從而細致地描畫DNA從損傷到修復的過程，以獲得更加精準的模型。
胡家志課題組的博士生尹健行，博士生劉孟竺和博士后劉陽為該文章的第一作者，該研究得到了國家自然科學基金、重大研發(fā)計劃和生命科學學院以及北大-清華生命科學聯(lián)合中心的支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-019-0088-8
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