合成生物學(xué)新進(jìn)展---浙江大學(xué)葉麗丹/于洪巍課題組在維生素E異源生物合成方面取得進(jìn)展
???? 維生素E是維持機(jī)體正常代謝和機(jī)能的必需維生素，包含α、β、γ、δ-生育酚（Tocopherol）和α、β、γ、δ-生育三烯酚（Tocoterienol）共8種化合物（圖1）。市面上主要的維生素E產(chǎn)品是化學(xué)合成的消旋DL-α-生育酚，以及少量植物提取的天然α-生育酚，前者主要用于動物營養(yǎng)，后者用于膳食補(bǔ)充劑。
圖1 維生素E化學(xué)結(jié)構(gòu)式
?相比生育酚，生育三烯酚具有更強(qiáng)的抗氧化特性，并且特有降低膽固醇、神經(jīng)保護(hù)和抗癌等生理功能，具備更廣闊的應(yīng)用前景。目前國外已有相應(yīng)膳食補(bǔ)充劑上市（圖2），功效成分主要為植物提取的4種天然生育三烯酚。盡管DL-α-生育酚的化學(xué)合成非常成熟，且成本低廉，但生育三烯酚尚未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的化學(xué)合成，并且在植物分布中的相對稀少，限制了其進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用。
圖2 國外的天然生育三烯酚膳食補(bǔ)充劑產(chǎn)品
?10月14日，浙江大學(xué)葉麗丹/于洪巍課題組在Nature Communications（DOI：10.1038/s41467-020-18958-9）上發(fā)表題為“Fermentative production of Vitamin E tocotrienols in Saccharomyces cerevisiae?under cold-shock-triggered temperature control”的研究性文章，在釀酒酵母工程菌株中實(shí)現(xiàn)了α-生育三烯酚的全生物合成，為發(fā)酵法生產(chǎn)該系列產(chǎn)品奠定了重要基礎(chǔ)。該文的第一作者為課題組碩士研究生沈斌。
圖3 生育三烯酚合成途徑及本研究所使用的5個關(guān)鍵基因
在該研究中，作者在14種光合生物中挖掘并篩選得到了合成生育三烯酚的5個關(guān)鍵基因元件（圖3），結(jié)合密碼子優(yōu)化和蛋白前導(dǎo)鏈的精準(zhǔn)切除，并結(jié)合釀酒酵母內(nèi)源的莽草酸途徑和MVA途徑，在非光合生物中成功實(shí)現(xiàn)終產(chǎn)物α-生育三烯酚的異源合成。進(jìn)一步通過確定并解除合成途徑的的關(guān)鍵限速步驟，上游途徑的綜合優(yōu)化，反饋抑制的解除，代謝平衡的重構(gòu)等一系列工程菌株的系統(tǒng)改造，最終在搖瓶培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)總生育三烯酚產(chǎn)量7.6 mg/g 細(xì)胞干重，比初產(chǎn)菌株提高了23.3
（圖4）。
圖4 多策略系統(tǒng)性改造提高釀酒酵母生物合成生育三烯酚
為了平衡細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成，作者在基于課題組前期開發(fā)的Gal4溫敏蛋白Gal4M9基礎(chǔ)上，進(jìn)一步引入層級調(diào)控，通過溫敏蛋白Gal4M9驅(qū)動野生型Gal4的表達(dá)（圖5）。
圖5 冷擊調(diào)控策略實(shí)現(xiàn)生物量及目標(biāo)產(chǎn)物的分階段積累
?通過采用新的溫控策略，只需若干個小時(shí)的冷擊，即可觸發(fā)打開產(chǎn)物合成的開關(guān)，相比該課題組之前開發(fā)需一直低溫維持產(chǎn)物合成的溫控誘導(dǎo)系統(tǒng)，升級的系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢：1）彌補(bǔ)了Gal4M9的活性損失，根據(jù)途徑需求定制轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的表達(dá)強(qiáng)度；2）大大降低了工業(yè)發(fā)酵過程中的能耗成本；3）避免了長期低溫對菌株生理代謝變緩的副作用。研究中結(jié)合采用新設(shè)計(jì)的冷擊溫控系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生育三烯酚工程菌株的細(xì)胞生物量積累和目標(biāo)產(chǎn)物積累的分階段控制，最后在5 L發(fā)酵罐中總生育三烯酚產(chǎn)量達(dá)到320 mg/L，為實(shí)現(xiàn)天然維生素E的全發(fā)酵法生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
圖6 冷擊調(diào)控策略控制基因表達(dá)合成天然生育三烯酚
?總體而言，該研究綜合了多基因生物合成途徑組裝、新基因挖掘、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)控制等手段，最終實(shí)現(xiàn)了采用真核底盤合成天然生育三烯酚，在采用合成生物學(xué)生產(chǎn)高附加值植物天然產(chǎn)物上又邁進(jìn)了重要一步。
?在過去的將近十年中，葉麗丹/于洪巍課題組采用釀酒酵母為底盤生物，先后在生物合成途徑的組裝方式（Decentralized Assembly，Biotechnology and Bioengineering 2014），基因表達(dá)順序調(diào)控策略（Sequential control, Metabolic Engineering, 2015），途徑組裝工具的開發(fā)（pMRI、pUMRI系列載體工具），酶工程與代謝工程相結(jié)合（Metabolic Engineering，2015；2017），生物合成途徑區(qū)室化（Nature Communications，2016）, GAL調(diào)控系統(tǒng)的改造，首創(chuàng)溫敏型GAL4（低溫活性型GAL4M9, Biotechnology and Bioengineering, 2018），以及在本研究中繼續(xù)升級的層級GAL4調(diào)控（低溫觸發(fā)型調(diào)控）。同時(shí)在大宗化學(xué)品（異戊二烯），色素系列（番茄紅素、β-胡蘿卜素、斑蝥黃、蝦青素，葉黃素），維生素系列（維生素A、維生素D、維生素E），香精香料（降龍涎香醚）等產(chǎn)品的開發(fā)方面不斷取得進(jìn)展，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
???? ?該工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“合成生物學(xué)專項(xiàng)”：合成植物天然產(chǎn)物的微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建及應(yīng)用示范（2018YFA0901800）以及國家自然科學(xué)基金（LY18B060001 to L. Y. and LZ20B060002 to H. Y.）的支持！
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