高紹榮教授課題組在《Stem Cell Reports》發(fā)表研究成果
2018年1月25日，同濟大學生命科學與技術學院高紹榮教授課題組與江賜忠教授課題組合作在Cell系列《Stem Cell Reports》雜志在線發(fā)表了題為“Reduced self-diploidization and improved survival of semi-cloned mice produced from androgenetic haploid embryonic stem cells through overexpression of Dnmt3b”的研究論文。研究工作揭示了Dnmt3b能恢復孤雄單倍體胚胎干細胞全基因組甲基化水平，延緩單倍體細胞的自發(fā)二倍體化，并提高半克隆小鼠發(fā)育潛能及存活能力。
孤雄單倍體胚胎干細胞（AG-haESCs）是指只具有一套來源于精子基因組的胚胎建立的一類特殊胚胎干細胞。由于其沒有母源的基因組，因此只具有20條染色體，并保留了部分雄性基因組的印跡特征，能夠替代精子使成熟卵母細胞受精，進而發(fā)育成為完整的小鼠，該小鼠也稱為半克隆小鼠（SC mice）。因此，孤雄單倍體胚胎干細胞在隱性遺傳基因篩選，基因功能研究和模式動物制作等方面具有重要的應用價值。但是，孤雄單倍體胚胎干細胞在培養(yǎng)過程中，會快速發(fā)生二倍體化，從而變成一類特殊的孤雄二倍體胚胎干細胞。此外，其制作半克隆小鼠的效率僅為0%-5%，且存活的半克隆小鼠中也只有約50%的小鼠正常發(fā)育至成年時期，這些缺陷極大的限制了AG-haESCs在科學研究中的廣泛應用。
高紹榮課題組在本項研究中，建立了來源于兩種基因型背景共6株孤雄單倍體胚胎干細胞系，并通過多種手段驗證了其多能性和分化潛能。通過RNA-seq等方法，研究發(fā)現(xiàn)孤雄單倍體與傳統(tǒng)胚胎干細胞相比，其從頭甲基化酶Dnmt3b以及輔助甲基化的Trim28,Pcna等基因都出現(xiàn)了低表達。此外，定量質(zhì)譜測序也進一步揭示了，該類細胞的全基因組甲基化（5mC）水平顯著低于二倍體胚胎干細胞。利用重亞硫酸鹽測序（Bisulfite sequencing）等方法，研究進一步明確了低甲基化主要存在于基因組的重復序列major satellite repeats 、minor satellite repeats、Line-1、IAP和一些印記基因(H19、Gtl2)的差異甲基化（DMR）區(qū)域。在AG-haESCs中過表達Dnmt3b，可顯著提高細胞全基因組甲基化的水平，部分恢復重復序列的甲基化狀態(tài)。同時，甲基化的恢復，還調(diào)控了特定細胞周期基因的表達，從而很大程度上抑制了細胞培養(yǎng)過程中二倍體化的發(fā)生。此外，研究中還聯(lián)合利用CRISPR/Cas9和RNAi技術，證明了從頭甲基化酶在孤雄單倍體胚胎早期發(fā)育以及建系等方面發(fā)揮重要作用。在進行體內(nèi)發(fā)育檢測，制作半克隆小鼠的過程中，研究發(fā)現(xiàn)野生型AG-haESCs中Dnmt3b的過表達，可以提高半克隆胚胎囊胚發(fā)育率和移植后的著床率。在DKO AG-haESCs中過表達Dnmt3b，可使得出生后半克隆小鼠存活到成年的比率從50%提高到了90%。
同濟大學高紹榮教授課題組的博士生何文騰和江賜忠教授課題組的張小白助理教授為本文共同第一作者，陳嘉瑜副教授、高紹榮教授和江賜忠教授為本文的共同通訊作者。參與此項研究工作的還有：張亞林、鄭煒圣、熊澤宇、胡欣潔、王明珠、張林鳳、趙堃、喬志斌、寇曉晨、趙艷紅、賴瑋毅力、呂聰、陳墨、徐睿敏、劉文強副研究員、李翀副研究員、王紅老師等。該項研究還得到了中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心汪海林課題組的大力幫助。本文的模式圖及文章插畫由金鈴繪制，在此深表感謝。本項目得到了國家自然科學基金委、科技部干細胞及轉(zhuǎn)化研究重點研發(fā)計劃、上海市科委以及上海市教委項目的資助。
全文鏈接：Stem Cell Reports-He.pdf
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