毛志勇教授團隊建立新的DNA修復檢測系統(tǒng)并闡述PARP1-SIRT1-BRG1信號軸在HR修復中的染色質密度調控機制
2019年7月10日，同濟大學生命科學與技術學院毛志勇教授課題組在《Nucleic acids research》上在線發(fā)表了題為“A PARP1-BRG1-SIRT1 axis promotes HR repair by reducing nucleosome density at DNA damage sites”的文章。該研究建立了一種基于紅色和綠色熒光的易于量化的新型DNA雙鏈斷裂修復（double strand break repair, DSBR）檢測手段；利用該方法，研究團隊深入闡述了PARP1-SIRT1-BRG1信號軸在HR修復中的染色質密度調控功能。
DNA雙鏈斷裂是對細胞危害最為嚴重的一類DNA損傷，而DSBR會高效修復這種損傷以求將對細胞的損害降到最低。DSBR可主要分為兩大類，一類依靠姐妹染色單體上的同源序列指導修復的精確進行，稱為同源重組（Homologous recombination, HR）；而另一類則直接將斷裂末端相連，往往造成DNA片段的插入或缺失，稱為非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）。這兩條通路的修復效率以及通路間的選擇與平衡伴隨著機體的生長發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展不斷動態(tài)變化，因此準確定量地分析染色質特定位點的HR與NHEJ效率及其之間的選擇與平衡有利于人們從基因組穩(wěn)定性的角度更深入地理解生、老、病、死的生物學過程。
為發(fā)展一種新型的檢測手段以同時分析兩條通路的相互關系，團隊基于綠色熒光蛋白GFP與紅色熒光蛋白tdTomato構建了一種雙報告載體并將其整合至細胞系中。在通過外源轉入內切酶I-SceI從而誘導載體發(fā)生定點雙鏈斷裂后，成功通過HR修復損傷的細胞會發(fā)出紅色熒光，而通過NHEJ完成修復的細胞則會發(fā)出綠色熒光。利用流式細胞技術，研究者便可同時定量分析成功發(fā)生HR或NHEJ修復的細胞比例，并得知細胞修復該位點損傷時在這兩種修復方式中選擇的偏好性。
接著，研究團隊將該報告載體整合至染色質不同位點建立了若干不同的細胞克隆。通過修復效率分析發(fā)現不同位點的HR效率存在著近72.6倍的巨大差異。進一步研究表明，這些位點的核小體密度與HR效率、HR/NHEJ偏好性均存在顯著負相關。此外，損傷發(fā)生后，斷裂位點鄰近區(qū)域的核小體密度也顯著降低。這些結果提示較為松散的染色質環(huán)境有利于HR修復的進行。
后續(xù)一系列機制研究表明：損傷發(fā)生后，多聚ADP核糖聚合酶PARP1催化產生的多聚ADP核糖鏈會通過與去乙?；窼IRT1的ZNF結構域及與ATP依賴的染色質重塑因子BRG1的ATPase結構域分別發(fā)生相互作用，從而招募其到達損傷位點。在損傷處，SIRT1對BRG1的1029及1033位賴氨酸進行去乙?；瘡亩鰪娖銩TPase活性，促進其松散損傷位點附近的核小體結構，進而有利于HR相關因子RPA2及RAD51招募，最終推動HR修復的進行。
毛志勇教授課題組長期致力于衰老及相關疾病如腫瘤相關的DNA損傷修復的研究工作。本次發(fā)表的研究成果是基于團隊前期參與開發(fā)的HR或NHEJ單報告載體進行的改進與升級，該工具為今后研究者精確研究胞內DNA雙鏈斷裂修復變化及調控機制提供了全新的選擇。此外，該工作通過闡述HR修復過程中PARP1-SIRT1-BRG1信號軸對核小體密度的調控作用，提示PARP1在HR修復中亦扮演重要角色，預示著PARP1抑制劑在HR通路激活的腫瘤類型的治療中也存在潛在的重要應用價值。
同濟大學生命科學與技術學院博士研究生陳御、張海萍及許柱為本文的共同第一作者。同濟大學生命科學與技術學院毛志勇教授、蔣穎副研究員及羅徹斯特大學Vera Gorbunova教授為本文的共同通訊作者。毛志勇課題組的博士研究生唐歡胤、耿安珂、蔡白蓮、蘇濤，江賜忠教授課題組的史偈君博士及羅徹斯特大學田驍博士也參與了相關研究。該工作同時得到了同濟大學江賜忠教授、浙江大學黃俊教授、同濟大學附屬第一婦嬰保健院萬小平教授及羅徹斯特大學Andrei Seluanov教授的支持。該研究成果得到國家重點研發(fā)計劃、優(yōu)秀青年科學基金、國家自然科學基金面上項目及上海市優(yōu)秀學術帶頭人計劃等經費的資助。
原文鏈接：
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkz592/5530672?searchresult=1
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