2020年9月14日，同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院高紹榮團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》雜志在線發(fā)表了題為“Precise allele-specific genome editing by spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 via pronuclear transplantation”的研究論文。在該項(xiàng)研究中，研究人員建立了一種名為Past-CRISPR（parental allele-specific gene-targeting）的方法，能夠高效的對(duì)親本特異性等位位點(diǎn)進(jìn)行編輯并能大幅的降低基因編輯模式動(dòng)物的嵌合率。
近年來發(fā)展起來的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以高效的對(duì)基因進(jìn)行編輯。通過向受精卵或卵母細(xì)胞共注射Cas9和sgRNA可以有效的產(chǎn)生基因編輯的模式動(dòng)物。然而，注射的Cas9一旦開始發(fā)揮作用即具有持續(xù)切割的能力，很難在時(shí)間及空間水平上精確地控制Cas9的活性。這限制了Cas9注射方法的應(yīng)用范圍并且突顯出了許多弊端。首先，傳統(tǒng)的顯微注射方法，由于具有持續(xù)的Cas9切割活性，其產(chǎn)生的基因編輯胚胎或者動(dòng)物絕大部分都存在著基因型嵌合，需要經(jīng)歷長時(shí)間的繁育純化過程。其次，目前還沒有一種有效的方法可以在胚胎中利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)親本特異性的位點(diǎn)進(jìn)行編輯。這些缺陷歸根結(jié)底是因?yàn)椴荒苡行У膶?duì)Cas9活性進(jìn)行時(shí)空特異性控制。
為了在時(shí)空精確調(diào)控CRISPR/Cas9的活性并實(shí)現(xiàn)精確的單等位位點(diǎn)的基因編輯，研究者們提出了兩點(diǎn)假設(shè)：第一，在生物體的整個(gè)生命周期中，受精卵原核期是能夠區(qū)分開父母源染色體組的唯一窗口，提供了對(duì)不同親本染色體位點(diǎn)進(jìn)行操作的空間。第二，受精卵中保留的Cas9/sgRNA可以通過原核互換的方法進(jìn)行胞質(zhì)的稀釋作用從而終止Cas9的編輯活性，可以用來精確調(diào)控CRISPR/Cas9的活性?；谶@兩點(diǎn)假設(shè)，研究者在MII期卵母細(xì)胞中共注射Cas9 mRNA及靶向目的基因的sgRNA之后進(jìn)行體外受精（IVF）。等到受精卵發(fā)育到PN3-4階段（7~9 h.p.f），將注射組受精卵的雌原核或者雄原核分別取出，并轉(zhuǎn)移到分別去除雌原核或者雄原核的正常受精卵中重構(gòu)出二倍體受精卵。理論上，重構(gòu)受精卵的一套染色體組已經(jīng)被編輯而另一套染色體組為野生型（Pat-ko/Mat-wt; Mat-ko/Pat-wt）（圖1）。
通過利用Past-CRISPR方法在多個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在保持正常的編輯效率（85.7%）的同時(shí)對(duì)各基因位點(diǎn)均具有高效的等位特異性的編輯效率（91.7%）。并且該方法能夠選擇性的對(duì)不同親本等位位點(diǎn)進(jìn)行編輯。同時(shí)，Past-CRIPSR方法與傳統(tǒng)的胚胎顯微注射方法相比，能夠產(chǎn)生更低的基因型嵌合率（7.1% VS 84.6%）。
接下來，研究者利用Past-CRISPR方法進(jìn)行了多種基因編輯的應(yīng)用。該方法能夠通過一步法對(duì)印記基因進(jìn)行功能及表型的鑒定；該方法能夠快速且有效的產(chǎn)生攜帶有突變致死基因的單等位突變的動(dòng)物模型，并且證明該致死突變可穩(wěn)定遺傳給后代；同時(shí)，該方法可通過一步法得到?jīng)]有基因型嵌合的完全基因敲除的動(dòng)物模型。最后，該方法還能用于對(duì)顯性遺傳疾病的治療，研究人員利用Fgfr3顯性突變導(dǎo)致的侏儒癥小鼠疾病模型（Gly369Cys），利用Past-CRISPR方法特異性地破壞顯性突變等位位點(diǎn)從而糾正子代骨發(fā)育異常的病理癥狀，阻斷了該疾病在子代中的傳播。
同濟(jì)大學(xué)博士研究生李延鶴為本文第一作者，高紹榮教授和劉文強(qiáng)研究員為本文共同通訊作者。本文的其他作者還包括高紹榮教授實(shí)驗(yàn)室的陳嘉瑜副教授，技術(shù)員寇曉晨和趙艷紅、柏丹丹、賈艷平、劉營東、張亞林、殷吉慶老師、王紅老師以及同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院王佐林教授和直博生翁雨藤。該研究得到了科技部、基金委和上海市科委等項(xiàng)目支持。