Plos Biology | 湯富酬課題組與喬杰課題組合作繪制人類視網(wǎng)膜高精度發(fā)育細(xì)胞圖譜
人類胚胎發(fā)育從受精卵開始，經(jīng)過著床前胚胎發(fā)育（胚內(nèi)和胚外組織的產(chǎn)生），原腸胚產(chǎn)生（三胚層的特化）和器官發(fā)生等階段，最終新生兒出生。人類胚胎發(fā)育從單個細(xì)胞到上萬億個細(xì)胞，歷時(shí)二百八十天，整個過程的基因表達(dá)受到多種因素的精細(xì)調(diào)控，其中很多機(jī)制尚未明確。
為了解析人類胚胎發(fā)育各個階段的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，自2010年起，北京大學(xué)北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院湯富酬課題組和北醫(yī)三院喬杰課題組就開始緊密合作，圍繞人類生殖系細(xì)胞（包括著床前胚胎細(xì)胞和著床后胚胎生殖細(xì)胞）發(fā)育的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制系統(tǒng)地開展研究工作（如圖1所示）。
首先，應(yīng)用湯富酬課題組發(fā)展的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)，湯富酬課題組和喬杰課題組繪制了完整的人類生殖系細(xì)胞的發(fā)育細(xì)胞圖譜，包括著床前胚胎的發(fā)育細(xì)胞圖譜（Yan et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2013; Dang et al., Genome Biology, 2016）和著床后胚胎生殖細(xì)胞的發(fā)育細(xì)胞圖譜（Guo et al., Cell, 2015;Li et al., Cell Stem Cell, 2017），并對其DNA甲基化、染色質(zhì)狀態(tài)等不同層面的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入的研究（Guo et al., Nature, 2014; Guo et al., Cell Research, 2017; Zhu et al., Nature Genetics, 2018; Li et al., Nature Cell Biology, 2018）。這兩個團(tuán)隊(duì)還與南方醫(yī)科大學(xué)趙小陽課題組合作完成了人類成年男性精子發(fā)生過程中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變和基因表達(dá)圖譜的繪制（Wang et al.,Cell Stem Cell, 2018）。
圖1湯富酬課題組和喬杰課題組合作項(xiàng)目概覽
此后，兩個團(tuán)隊(duì)全面展開對人類生殖系細(xì)胞以及非生殖系的各種重要器官的發(fā)育細(xì)胞圖譜的研究，最終目標(biāo)是繪制出人類胚胎發(fā)育所有重要階段、所有主要器官系統(tǒng)的高精度發(fā)育細(xì)胞圖譜。2018年，他們與中科院生物物理所王曉群課題組等合作，繪制了首個來自外胚層的人腦前額葉發(fā)育的單細(xì)胞圖譜，揭示了神經(jīng)元分化的成熟機(jī)制（Zhong et al., Nature, 2018）。他們還對人類胚胎大腦皮層的所有主要腦區(qū)進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究，揭示了大腦皮層的區(qū)域化基因表達(dá)和神經(jīng)元成熟的重要特征 （Fan et al., Cell Research, 2018）。上述工作為繪制完整的人腦發(fā)育細(xì)胞圖譜奠定了重要的基礎(chǔ)。與此同時(shí)，對來自內(nèi)胚層的消化道四種主要器官（食道、胃、小腸和大腸），兩個團(tuán)隊(duì)研究了它們在人類胚胎發(fā)育過程中的基因表達(dá)圖譜及其信號調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步解析了從胎兒到成年大腸的發(fā)育、成熟路徑和關(guān)鍵生物學(xué)特征 （Gao et al., Nature Cell Biology, 2018）。另外，這兩個團(tuán)隊(duì)還合作開展了對來自中胚層的腎臟和心臟的發(fā)育細(xì)胞圖譜研究。對于腎臟，他們深入研究了完整腎單位的細(xì)胞分化發(fā)育過程，闡釋了由腎單位前體細(xì)胞逐步分化產(chǎn)生不同類型的腎小管上皮細(xì)胞過程中對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控事件和信號通路調(diào)節(jié)機(jī)制（Wang et al., Cell Reports, 2018）。對于心臟，他們揭示了心臟發(fā)育過程中關(guān)鍵信號通路的時(shí)空特異性激活特征以及心肌細(xì)胞與非心肌細(xì)胞之間的復(fù)雜信號互作機(jī)制，為心臟再生的研究提供了重要線索（Cui et al., Cell Reports, 2018）。
2019年7月3日，人類主要器官發(fā)育圖譜又添新作，湯富酬課題組與喬杰課題組在《Plos Biology》雜志上在線發(fā)表了題為“Dissecting the transcriptome landscape of the human fetal neural retina and retinal pigment epithelium by single-cell RNA-seq analysis”（通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析解析人類胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層的轉(zhuǎn)錄組圖譜）的研究成果，對來自外胚層的視網(wǎng)膜進(jìn)行了深入的發(fā)育細(xì)胞圖譜研究。
眼睛是心靈的窗戶，而視網(wǎng)膜可以將外界的光轉(zhuǎn)化為神經(jīng)信號，是眼睛實(shí)現(xiàn)感光功能非常重要的組成部分。視網(wǎng)膜內(nèi)層是神經(jīng)層（主要包含視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和繆勒細(xì)胞等），外層是色素上皮層（如圖2所示）。目前，已有大量的基于小鼠模型的研究揭示了視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素層的發(fā)育路線。但是，人類視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素層發(fā)育的分子機(jī)制以及這兩層結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞間的相互作用關(guān)系尚未明確。該課題組對來自人類胚胎5周到24周的視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層（RPE）的2400多個細(xì)胞進(jìn)行了高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析。主要發(fā)現(xiàn)有：
圖2人類視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層的示意圖
1. 揭示了人類胚胎視網(wǎng)膜的關(guān)鍵時(shí)空發(fā)育特征
該研究對視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層分別取樣，轉(zhuǎn)錄組分析（如圖3所示）顯示神經(jīng)層特異表達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的基因，而色素層特異表達(dá)的基因與視黃醇代謝相關(guān)。隨著胚胎的發(fā)育，這兩種組織都經(jīng)歷了由早期的細(xì)胞增殖高度活躍的狀態(tài)到視覺感知逐漸成熟的狀態(tài)。發(fā)育后期兩者都參與視網(wǎng)膜的視覺感知，暗示了它們在發(fā)育后期可能存在功能上的相互作用。
圖3視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征
該研究鑒定出了各個類群對應(yīng)的細(xì)胞類型（如圖4所示），描繪了各個細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并且揭示了體內(nèi)發(fā)育過程中各種主要的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生的準(zhǔn)確時(shí)間。例如，在人類胚胎發(fā)育的第5周，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)，并在第8周時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到峰值。在胚胎第7周的時(shí)候可以檢測到水平細(xì)胞，在胚胎第9周，這種細(xì)胞的密度達(dá)到峰值。隨后，無長突細(xì)胞，光感受器細(xì)胞和繆勒細(xì)胞等相繼出現(xiàn)。
圖4人類胚胎視網(wǎng)膜的主要細(xì)胞類型和細(xì)胞發(fā)生時(shí)序
2．揭示了參與視網(wǎng)膜發(fā)育的細(xì)胞類型特異的轉(zhuǎn)錄因子及其靶標(biāo)基因
視網(wǎng)膜發(fā)育研究的一個重要生物學(xué)問題是受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的細(xì)胞命運(yùn)決定的機(jī)制研究。該研究提供了一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子圖譜。這些轉(zhuǎn)錄因子在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞中高度活躍，并且它們的靶標(biāo)基因參與了視網(wǎng)膜發(fā)育的重要事件（如圖5所示）。例如，轉(zhuǎn)錄因子RAX2主要在光感受器細(xì)胞中活躍，隨著視網(wǎng)膜的發(fā)育，有一部分RAX2靶標(biāo)基因的表達(dá)上調(diào)，這些基因參與了視覺感知和光刺激的檢測，這與光感受器細(xì)胞的功能相符。MITF只在色素上皮細(xì)胞中有很高的活性，它的靶標(biāo)基因在早期參與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)管的閉合，晚期參與陽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。整個發(fā)育過程中，有一部分MITF的靶標(biāo)基因持續(xù)表達(dá)，這些基因參與色素沉淀和細(xì)胞動力的調(diào)控。MITF靶標(biāo)基因參與的上述事件都與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的功能吻合。
圖5細(xì)胞類型特異的轉(zhuǎn)錄因子及其靶標(biāo)基因參與的發(fā)育事件
3．揭示了RPE細(xì)胞與光感受器細(xì)胞的重要相互作用
該研究提供了RPE細(xì)胞與光感受細(xì)胞相互作用的諸多線索（如圖6所示）。成體的視網(wǎng)膜中，RPE細(xì)胞與光感受器細(xì)胞共同參與視循環(huán)-光轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。有報(bào)道稱光轉(zhuǎn)導(dǎo)始于視紫紅質(zhì)吸收光子。在人類胚胎發(fā)育過程中，直到第24周，光感受器細(xì)胞中才第一次檢測到視紫紅質(zhì)基因的表達(dá)。然而在視網(wǎng)膜色素細(xì)胞中，第13周的時(shí)候就可以檢測到一系列與視循環(huán)相關(guān)基因的表達(dá)。上述結(jié)果說明，胚胎發(fā)育的第13周，視網(wǎng)膜已經(jīng)開始視循環(huán)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于光轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生。該研究還檢測到了成對的受體與配體基因在RPE細(xì)胞和光感受器細(xì)胞中的表達(dá)，這也為研究兩種細(xì)胞的相互作用提供了重要線索。
圖6RPE細(xì)胞與光感受器細(xì)胞的相互作用
4．揭示了視覺相關(guān)疾病潛在靶點(diǎn)基因在發(fā)育過程中的時(shí)空特異性表達(dá)特征
該研究繪制了胚胎時(shí)期視網(wǎng)膜細(xì)胞中遺傳疾病相關(guān)基因的表達(dá)譜。研究結(jié)果顯示大部分疾病相關(guān)的基因在光感受器細(xì)胞，雙極細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞中富集。有報(bào)道顯示，在中國人群中，USH2A, EYS和CRB1是導(dǎo)致遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良貢獻(xiàn)最大的三個基因。而在人類胚胎的視網(wǎng)膜中，USH2A主要在光感受器細(xì)胞中表達(dá)，EYS在雙極細(xì)胞和光感受器細(xì)胞中高表達(dá)，CRB1在繆勒細(xì)胞和視網(wǎng)膜前體細(xì)胞中富集。視網(wǎng)膜前體細(xì)胞是對視網(wǎng)膜形成至關(guān)重要的細(xì)胞類群，該研究發(fā)現(xiàn)它還高表達(dá)CLRN1, KCNJ13和KIF11等基因，視網(wǎng)膜遺傳性疾病相關(guān)的基因在視網(wǎng)膜前體細(xì)胞中的突變可能是研究疾病發(fā)展的重要線索。
總之，該研究繪制了高精度的人類視網(wǎng)膜單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，解析了細(xì)胞類型特異的轉(zhuǎn)錄因子及其靶標(biāo)基因參與的發(fā)育事件，探索了視網(wǎng)膜神經(jīng)層與視網(wǎng)膜色素層在發(fā)育時(shí)期相互作用的方式，同時(shí)該研究還繪制了胚胎時(shí)期視網(wǎng)膜細(xì)胞的遺傳疾病相關(guān)基因的表達(dá)譜。這項(xiàng)成果為人類視網(wǎng)膜發(fā)育的功能性研究和視網(wǎng)膜遺傳性疾病的研究提供了重要線索。
北京大學(xué)北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院博士后胡玉瓊，北醫(yī)三院王曉曄，北京大學(xué)北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院博士胡博強(qiáng)、博士生毛雨諾和陳依東為該論文的并列第一作者，湯富酬教授和喬杰教授為該論文的共同通訊作者。該項(xiàng)工作得到了國家重大科學(xué)研究計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金委、未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心以及生命科學(xué)聯(lián)合中心（CLS）等的支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000365
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