陳亮課題組在《NatureProtocols》上發(fā)表方法學(xué)論文
2019年4月17日，《Nature Protocols》（IF=12.423）在線發(fā)表題為“R-ChIPfor Genome-wide Mapping of R-loops by Using Catalytically Inactive RNASEH1”的方法學(xué)論文，我院陳亮研究員為該文的共同通訊作者。該工作獲得了武漢大學(xué)引進(jìn)人才啟動經(jīng)費(fèi)的資助。
當(dāng)由轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA與模板DNA通過堿基互補(bǔ)配對形成雜合鏈時，另外一條非模板DNA鏈將處于單鏈狀態(tài)，由此形成的三鏈核酸結(jié)構(gòu)稱為R-loop。R-loop廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物與動物的基因組中，在基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、表觀遺傳修飾以及DNA損傷修復(fù)等過程中都具有重要作用，并與許多重大疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是近年來分子生物學(xué)的一個新研究熱點(diǎn)。R-loop研究非常依賴能夠準(zhǔn)確定位與定量R-loop結(jié)構(gòu)的檢測技術(shù)。此前廣泛應(yīng)用的DRIP-seq技術(shù)主要利用識別RNA/DNA雜合鏈的單克隆抗體S9.6對R-loop進(jìn)行體外富集，并進(jìn)行建庫測序。該方法可以在全基因組水平對R-loop信號進(jìn)行檢測，但也存在若干技術(shù)問題，包括檢測信號的分辨率有限和S9.6抗體的特異性不足。此外，體外富集的DRIP-seq信號能否真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)R-loop的水平仍存在爭議。解決這些問題并進(jìn)一步推動R-loop研究的進(jìn)展亟待獨(dú)立新技術(shù)的開發(fā)。
本文報道的新技術(shù)R-ChIP通過在細(xì)胞中表達(dá)RNASEH1突變體（RNASEH1為特異性切割R-loop的內(nèi)切酶，經(jīng)突變改造后失去催化功能，但其R-loop結(jié)合活性被保留），可特異性識別體內(nèi)形成的R-loop，通過富集和文庫的建立與測序，即可繪制細(xì)胞內(nèi)R-loop的全基因組圖譜。該方法具有三個特點(diǎn):1)內(nèi)源性，直接在細(xì)胞體內(nèi)捕獲R-loop；2）高分辨率,檢測精度在200個堿基左右；3）高特異性,研究者可以使用RNASEH1催化/結(jié)合位點(diǎn)雙突變體的R-ChIP數(shù)據(jù)做為陰性對照，進(jìn)一步提高R-loop識別信號的特異性。陳亮研究員在此前的工作中利用R-ChIP技術(shù)對R-loop的動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶的停滯是促進(jìn)R-loop形成的重要原因，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄區(qū)域DNA的GC分布以及非模板鏈形成的二級結(jié)構(gòu)對R-loop的形成具有重要影響（Chen et al, 2017, Mol Cell）。在R-loop與重大疾病關(guān)系的研究中，陳亮研究員運(yùn)用R-ChIP技術(shù)發(fā)現(xiàn)在骨髓增生異常綜合癥（MDS）中，多種剪接因子的突變均造成造血干細(xì)胞R-loop水平的紊亂，從而影響基因組的穩(wěn)定性與細(xì)胞功能維持（Chen et al, 2018, Mol Cell），提示R-loop異?？赡苁荕DS疾病發(fā)生的重要機(jī)制，為MDS與白血病的研究和治療提供了全新視角。
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