Nature | 湯富酬課題組攜手合作者利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組圖譜重構(gòu)人類(lèi)胚胎著床過(guò)程
摘要
胚胎著床是包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中的里程碑事件，生理狀態(tài)下超過(guò)半數(shù)以上的人類(lèi)胚胎由于無(wú)法順利著床導(dǎo)致不孕。既往研究通常使用小鼠和食蟹猴等模式生物對(duì)這一過(guò)程展開(kāi)探索，然而調(diào)控圍著床時(shí)
期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制和形態(tài)學(xué)變化特征在不同物種之間存在較大差異，這使得在小鼠等模式生物研究中獲得的調(diào)控規(guī)律較難為人類(lèi)胚胎發(fā)育研究提供有價(jià)值的線(xiàn)索。然而，由于人類(lèi)胚胎著床發(fā)生在受精卵形成后一周左右的時(shí)間點(diǎn)，這使得研究者們無(wú)法獲得生理狀況下的這一發(fā)育階段的人類(lèi)胚胎。長(zhǎng)期以來(lái)，這一人類(lèi)關(guān)鍵發(fā)育階段一直成為發(fā)育生物學(xué)研究的黑匣子。為了深入探討這一過(guò)程中的分子動(dòng)態(tài)規(guī)律，挖掘調(diào)控胚胎著床過(guò)程中的潛在分子機(jī)制，2019年8月22日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬課題組攜手北京大學(xué)第三醫(yī)院?jiǎn)探苷n題組合作在Nature在線(xiàn)發(fā)表了題為Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation的研究論文。結(jié)合體外模擬人類(lèi)著床策略1和高精度單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)2,3（single-cell RNA-seq, single-cell Trio-seq2），首次利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組圖譜重構(gòu)了人類(lèi)胚胎著床過(guò)程，系統(tǒng)解析了這一關(guān)鍵發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。研究者們發(fā)現(xiàn)圍著床時(shí)期人類(lèi)胚胎的三個(gè)主要細(xì)胞譜系（上胚層、原始內(nèi)胚層、滋養(yǎng)外胚層）表現(xiàn)出獨(dú)特的發(fā)育特征，而且胚胎在這一時(shí)期迅速呈現(xiàn)出母胎連接預(yù)備狀態(tài)；隨后，作者發(fā)現(xiàn)在可觀察事件窗口期內(nèi)（體外培養(yǎng)day12以前），雌雄胚胎的X染色體劑量并未達(dá)到平衡，且雌性胚胎逐漸啟動(dòng)并逐漸呈現(xiàn)出父源或母源X染色體隨機(jī)失活趨勢(shì)；最后，研究者們利用單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序手段發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞譜系具有截然不同的DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化特征，提示基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和DNA甲基化可能共同協(xié)調(diào)決定囊胚階段后的細(xì)胞譜系命運(yùn)決定。
引言
人類(lèi)胚胎發(fā)育從具有全能性的受精卵開(kāi)始，伴隨著多次卵裂和分裂從而形成一個(gè)具有特定結(jié)構(gòu)的囊胚。囊胚主要由外圍的外滋養(yǎng)層細(xì)胞（trophectoderm，TE）和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）細(xì)胞組成，而成熟的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)會(huì)進(jìn)一步發(fā)育成為具有多能性的上胚層（epiblast，EPI）和原始內(nèi)胚層（primitive endoderm，PE）。囊胚著床之后TE主要分化為胚外滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)，例如胎盤(pán)等；而上胚層主要會(huì)發(fā)育形成胎體的各個(gè)組織器官。隨著體外受精技術(shù)的革新，人類(lèi)早期著床前胚胎發(fā)育過(guò)程被廣泛研究 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 4,5。然而，在發(fā)育的第5-7天，胚胎必須通過(guò)著床進(jìn)入母體子宮壁才能繼續(xù)存活和發(fā)育，隨后逐漸形成原腸胚，并進(jìn)一步分化形成各類(lèi)器官和組織原基。
著床失敗是導(dǎo)致早期流產(chǎn)的重要因素之一6。然而研究者們幾乎無(wú)法獲得自然受孕后的早期著床后階段的人類(lèi)胚胎，導(dǎo)致人們對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中這一關(guān)鍵階段的譜系特化和分子調(diào)控等規(guī)律知之甚少。猴子胚胎曾被用于早期胚胎發(fā)育研究7，但著床后早期胚胎的猴子模型與人類(lèi)仍然存在一定的物種差異。小鼠作為最常見(jiàn)模式生物被廣泛應(yīng)用于早期胚胎研究。人類(lèi)囊胚與子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系為模擬體內(nèi)著床后發(fā)育過(guò)程提供了另一實(shí)驗(yàn)策略8，然而這類(lèi)研究策略對(duì)于著床后發(fā)育過(guò)程的重現(xiàn)程度和可重復(fù)性存在一定問(wèn)題。尤其是該體系必須有母體組織的參與，因此較難被推廣使用，且無(wú)法應(yīng)用于胚胎的自主性構(gòu)建（self-organization）研究。2016年，Magdalena Zernicka-Goetz實(shí)驗(yàn)室建立了小鼠著床后胚胎的體外培養(yǎng)體系，該研究組利用獨(dú)特的培養(yǎng)條件將小鼠著床前的囊胚進(jìn)行體外培養(yǎng)，直至形成類(lèi)似于著床后胚胎的三胚層結(jié)構(gòu)，為闡明早期著床后胚胎發(fā)育提供了重要實(shí)驗(yàn)手段9。
然而，不同哺乳動(dòng)物胚胎類(lèi)型之間存在較明顯的物種差異，說(shuō)明從小鼠到人類(lèi)之間的發(fā)育過(guò)程的研究推理從而獲得的有效結(jié)論非常有限，這意味著人類(lèi)著床后胚胎形態(tài)學(xué)和分子調(diào)控等變化規(guī)律最好能直接通過(guò)人類(lèi)胚胎研究來(lái)獲取。相比小鼠來(lái)說(shuō)，人類(lèi)囊胚形成過(guò)程中的分子和細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究仍然偏少，已有研究暗示二者在譜系分化和功能方面存在時(shí)間和潛能上的巨大差異10。Ali H. Brivanlou實(shí)驗(yàn)室以及Magdalena Zernicka-Goetz實(shí)驗(yàn)室近期將小鼠著床后胚胎培養(yǎng)體系進(jìn)一步發(fā)展至人類(lèi)胚胎，新建的培養(yǎng)體系同樣能促進(jìn)人類(lèi)胚胎在體外經(jīng)歷著床前向著床后的轉(zhuǎn)化與發(fā)育，培養(yǎng)體系無(wú)需母體組織參與；形態(tài)學(xué)證據(jù)揭示了在這一階段人類(lèi)胚胎發(fā)育的主要特征，表明人類(lèi)胚胎在著床后期具有自我構(gòu)建（self-organization）特性，這極大的豐富了人們對(duì)于人類(lèi)胚胎著床這一生物學(xué)過(guò)程的認(rèn)識(shí)1,11。
細(xì)胞身份識(shí)別和命運(yùn)取決于其基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)該網(wǎng)絡(luò)受到復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳學(xué)等機(jī)制調(diào)控。解析人類(lèi)胚胎細(xì)胞基因表達(dá)的時(shí)空特異性模式對(duì)于了解胚胎早期發(fā)育過(guò)程至關(guān)重要。將單細(xì)胞分辨率組學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于人類(lèi)胚胎發(fā)育研究使人們精確認(rèn)識(shí)這一過(guò)程成為了可能。湯富酬課題組和喬杰課題組長(zhǎng)期緊密合作，致力于包括著床前胚胎在內(nèi)的人類(lèi)生殖系細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)調(diào)控特征和潛在的機(jī)制研究：2013年，結(jié)合湯富酬課題組發(fā)展的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)12，繪制了人類(lèi)著床前胚胎的高精度單細(xì)胞基因表達(dá)特征圖譜（Nature Structural & Molecular Biology，201313；2014年，該課題組利用新發(fā)展的微量細(xì)胞DNA甲基化組測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)解析了人類(lèi)著床前胚胎發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化組重編程動(dòng)態(tài)特征（Nature，201414；2018年，該團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞DNA甲基化高通量測(cè)序技術(shù)在單細(xì)胞水平解析了人類(lèi)著床前胚胎發(fā)育的DNA甲基化組圖譜（Nature Genetics，201815。同年，他們利用單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)解析了人類(lèi)著床前胚胎發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化組和染色質(zhì)狀態(tài)組的重編程過(guò)程，以及染色質(zhì)狀態(tài)與DNA甲基化之間的相互關(guān)系（Nature Cell Biology，201816。以上各項(xiàng)研究極大豐富了人們對(duì)于人類(lèi)著床前胚胎基因表達(dá)和表觀遺傳調(diào)控規(guī)律的認(rèn)知。此外，多個(gè)課題組曾利用一系列單細(xì)胞技術(shù)對(duì)人類(lèi)著床前胚胎的分子表達(dá)譜進(jìn)行了系統(tǒng)性解析 17,18。然而受困于技術(shù)限制，胚胎著床這一關(guān)鍵發(fā)育階段的多維度分子表達(dá)特征，尤其是該過(guò)程中譜系特異性分子表達(dá)譜和潛在的調(diào)控規(guī)律長(zhǎng)期以來(lái)一直是未解之謎。
為此，兩個(gè)課題組再次攜手合作，結(jié)合人類(lèi)胚胎體外培養(yǎng)體系與單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和多組學(xué)測(cè)序），系統(tǒng)揭示了人類(lèi)早期著床后胚胎發(fā)育過(guò)程中的分子表達(dá)圖譜，并在此基礎(chǔ)上挖掘了基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、DNA甲基化動(dòng)態(tài)特征等潛在分子調(diào)控機(jī)制。
結(jié)果
1. 人類(lèi)胚胎在囊胚階段后期具備體外自我生長(zhǎng)能力（體外模擬胚胎著床）
為了證實(shí)胚胎在體外無(wú)母體組織參與情況下的著床過(guò)程，研究者根據(jù)已報(bào)道胚胎培養(yǎng)策略重現(xiàn)了胚胎形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)變化特征 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 1,11。證據(jù)顯示胚胎在無(wú)母體組織參與下能發(fā)育至第12/14天，胚胎逐漸呈現(xiàn)出特異性的形態(tài)學(xué)特征，例如滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞數(shù)量大幅度增加，上胚層逐漸形成羊膜腔以及原始內(nèi)胚層逐漸生長(zhǎng)并逐漸包圍上胚層（圖1，視頻1）。根據(jù)國(guó)際倫理學(xué)準(zhǔn)則，研究者們?cè)诘?4天終止了體外胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
圖1 人類(lèi)胚胎體外模擬著床生長(zhǎng)過(guò)程（day6-12）
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視頻1 人類(lèi)圍著床時(shí)期胚胎三維重建結(jié)構(gòu)（day12）
2. 不同細(xì)胞譜系的關(guān)鍵發(fā)育特征以及特征性基因挖掘
研究者利用已知的譜系標(biāo)志基因?qū)矔r(shí)期的胚胎細(xì)胞進(jìn)行了譜系鑒定，結(jié)果顯示胚胎基本維持了囊胚晚期的三個(gè)主要細(xì)胞譜系（上胚層、原始內(nèi)胚層、滋養(yǎng)外胚層）。有趣的是，各個(gè)譜系均逐漸呈現(xiàn)出各自獨(dú)特的基因表達(dá)特征，例如上胚層呈現(xiàn)出明確的多能性轉(zhuǎn)變（pluripotency transition），原始內(nèi)胚層則逐漸開(kāi)始表達(dá)卵黃囊發(fā)育相關(guān)基因（例如CD44），而滋養(yǎng)外胚層則逐漸開(kāi)始表達(dá)荷爾蒙相關(guān)基因（例如CGB家族基因），以上特征均提示胚胎在這一關(guān)鍵發(fā)育階段逐漸呈現(xiàn)出母胎連接預(yù)備狀態(tài)（圖2）。不同細(xì)胞譜系之間的基因表達(dá)對(duì)比分析，各類(lèi)細(xì)胞譜系均具備獨(dú)特的特征性基因（signature gene）。且部分基因與已發(fā)表食蟹猴圍著床時(shí)期胚胎相關(guān)譜系的基因表達(dá)特征類(lèi)似（圖3）。
圖2 人類(lèi)圍著床時(shí)期胚胎的譜系鑒定和各自的發(fā)育學(xué)特征
圖3人類(lèi)與食蟹猴著床后胚胎細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜對(duì)比分析
另一方面，OTX2過(guò)去曾被報(bào)道是圍著床時(shí)期胚胎上胚層（EPI）多能性轉(zhuǎn)化（pluripotency transition）的重要標(biāo)志基因19，然而在本研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示OTX2主要表達(dá)在原始內(nèi)胚層（PE），而并非上胚層（EPI）。進(jìn)一步全胚胎免疫熒光染色顯示OTX2表達(dá)在部分原始內(nèi)胚層細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。這表明具有相同發(fā)育來(lái)源（內(nèi)細(xì)胞團(tuán)起源）的兩類(lèi)細(xì)胞（上胚層細(xì)胞和原始內(nèi)胚層細(xì)胞）可能攜帶特殊基因表達(dá)痕跡（圖4）。這些數(shù)據(jù)提示該研究中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的潛在資源價(jià)值，新的譜系標(biāo)記基因鑒定可能有助于早期胚胎中的譜系鑒定和干/祖細(xì)胞衍生研究。
圖4 OTX2在圍著床時(shí)期胚胎的表達(dá)情況
3. 滋養(yǎng)外胚層特化成為兩類(lèi)亞群
研究者們發(fā)現(xiàn)隨著圍著床時(shí)期胚胎的發(fā)育，滋養(yǎng)外胚層逐漸形成兩類(lèi)亞群，其中一類(lèi)亞群主要表達(dá)女性妊娠相關(guān)基因，而另一類(lèi)亞群則幾乎不表達(dá)該類(lèi)基因。隨后這兩類(lèi)細(xì)胞被鑒定為細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（cytotrophoblasts，CTs）和合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（syncytiotrophoblasts，STs），除激素相關(guān)基因外，合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（STs）還表達(dá)部分新發(fā)現(xiàn)的基因，例如TCL6和TBX3（圖5）。
圖5 滋養(yǎng)外胚層（TE）兩類(lèi)亞群的特征性基因表達(dá)譜
4. X染色體劑量平衡
自1961年Lyon等人報(bào)道雌雄個(gè)體之間的X染色體劑量特征后，X染色體劑量平衡一直是發(fā)育生物學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)之一20。X染色體失活（XCI）對(duì)于女性（XX）與男性（XY）之間X連鎖基因的劑量平衡具有重要意義，同時(shí)X染色體上調(diào)（XCU）對(duì)于X連鎖基因與常染色體基因之間的劑量平衡具有重要意義。2016年Fredrik Lanner團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道雌雄胚胎的X染色體劑量在囊胚階段幾乎已達(dá)平衡，且為X染色體阻滯模式（X-dampening，雌性細(xì)胞兩條X染色體劑量均部分下調(diào)）17。在本研究中，作者們捕獲到了多個(gè)階段的雌雄胚胎，這為系統(tǒng)揭示這一過(guò)程中的關(guān)鍵生物學(xué)細(xì)節(jié)提供了可能?？勺粉櫢改冈吹任换虮磉_(dá)的單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析顯示，在可觀察事件窗口內(nèi)（day12以前），雌雄胚胎的X染色體劑量并未達(dá)到平衡，且雌性胚胎逐漸啟動(dòng)并逐漸呈現(xiàn)出父源或者母源X染色體隨機(jī)失活趨勢(shì)（XCI）（圖6）。另一方面，X染色體劑量應(yīng)與常染色體基因的表達(dá)量平衡則需要雌性與雄性中的X染色體上調(diào)（XCU）來(lái)實(shí)現(xiàn)，在晚期胚胎單細(xì)胞中活躍的那條X染色體（雄性細(xì)胞中僅含一條X染色體，處于活躍狀態(tài)；雌性細(xì)胞則含有一條活躍的X染色體和一條失活的X染色體）需要上調(diào)表達(dá)劑量?jī)杀?，達(dá)到跟同一個(gè)細(xì)胞中每個(gè)常染色體兩個(gè)拷貝同樣的表達(dá)劑量（X染色體/常染色體的表達(dá)劑量比從1：2上調(diào)到2：2）。該研究發(fā)現(xiàn)X染色體上調(diào)在著床階段的雌性和雄性胚胎細(xì)胞中均已經(jīng)啟動(dòng)，但是還沒(méi)有達(dá)到上調(diào)兩倍表達(dá)劑量的完成狀態(tài)。此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)圍著床時(shí)期胚胎還存在著一定程度的拷貝數(shù)變異（CNV），且拷貝數(shù)變異并未影響主要譜系的整體基因表達(dá)特征。
圖6 圍著床時(shí)期胚胎的X染色體劑量動(dòng)態(tài)變化過(guò)程
5. 譜系特異性DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化規(guī)律
為進(jìn)一步分析胚胎著床過(guò)程中的基因組甲基化特征，研究者們利用該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建的單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)對(duì)三類(lèi)細(xì)胞譜系的基因組甲基化過(guò)程進(jìn)行了深度分析。圍著床階段胚胎細(xì)胞在DNA甲基化特征水平分布成4個(gè)主要細(xì)胞群體（圖7）：囊胚期（day 6）上胚層/原始內(nèi)胚層/滋養(yǎng)外胚層、著床后時(shí)期（day8/10）上胚層、著床后時(shí)期（day8-12）原始內(nèi)胚層、以及著床后時(shí)期（day8-12）滋養(yǎng)外胚層。該結(jié)果說(shuō)明三類(lèi)細(xì)胞譜系在囊胚發(fā)育階段（著床前）具有相似的DNA甲基化模式 版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁(yè)的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開(kāi)發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com