復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院顧宏周課題組報(bào)道脫氧核酶的活性改進(jìn)
2018年05月24日，生物醫(yī)學(xué)研究院顧宏周課題組與中山醫(yī)院李華課題組聯(lián)合在《ACS Catalysis》上在線發(fā)表了題為《 Retraining and Optimizing DNA-hydrolyzing Deoxyribozymes for Robust Single- and Multiple-turnover Activities》的研究論文，揭示了脫氧核酶（deoxyribozymes）的優(yōu)化策略和在生物工程技術(shù)方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。
脫氧核酶是一類特定序列的具有酶活性的單鏈DNA，可通過“試管內(nèi)進(jìn)化”的方法獲得。自1994年首次發(fā)現(xiàn)以來，已有幾十種催化不同反應(yīng)的脫氧核酶被分離來，包括DNA磷酸化、腺苷化、去糖基化，DNA/RNA連接，RNA切割，以及DNA磷酸二酯鍵水解等。這類由DNA構(gòu)成的酶在細(xì)胞內(nèi)天然存在的證據(jù)依然在探索中，但將其用于細(xì)胞內(nèi)干預(yù)特定的信號通路從而抑制腫瘤的發(fā)生和生長已得到了廣泛認(rèn)可和現(xiàn)實(shí)應(yīng)用。
圖1. I-R1的突變型分子中突變位點(diǎn)及突變型的反應(yīng)速率測試
與蛋白酶相比較，已知的脫氧核酶在單個(gè)turnover周期內(nèi)的反應(yīng)速率和多個(gè)turnover間的轉(zhuǎn)換率都有一定的差距。聯(lián)合課題組以特異感應(yīng)鋅離子并在特定位點(diǎn)水解切割DNA的I類脫氧核酶為例，對其已知的序列作退化處理構(gòu)建初始DNA文庫，通過體外再次篩選分離得到了脫氧核酶I-R1亞型的三個(gè)突變體：I-R1a-c（圖1）。與I-R1相比，突變體單個(gè)turnover內(nèi)的反應(yīng)速率均提高了10倍以上，半衰期縮短到1分鐘左右，達(dá)到或接近蛋白酶和RNA酶在體外被觀察到的反應(yīng)速率。同時(shí)，聯(lián)合課題組通過簡單的熱循環(huán)操作促進(jìn)底物和酶之間的結(jié)合及分離（圖2），將Ι類脫氧核酶的turnover間的轉(zhuǎn)換率提高了約30倍，有效kcat值達(dá)到了0.5 min-1，同樣接近于蛋白酶的體外活性。該研究為脫氧核酶的系統(tǒng)性優(yōu)化提供了一種廣泛適用的策略，同時(shí)也為可水解切割DNA的脫氧核酶作為一種高效的分子生物學(xué)工具奠定了基礎(chǔ)。
圖2. 熱循環(huán)促進(jìn)的multiple-turnover反應(yīng)示意圖
復(fù)旦大學(xué)顧宏周研究員和李華研究員為論文的共同通訊作者，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院博士生杜鑫雨和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院博士生仲昕醫(yī)師為論文的共同第一作者。
論文原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.8b01466
Xinyu Du,# Xin Zhong,# Wei Li, Hua Li,* Hongzhou Gu.* “Retraining and Optimizing DNA-hydrolyzing Deoxyribozymes for Robust Single- and Multiple-turnover Activities.” ACS Catalysis 2018, DOI: 10.1021/acscatal.8b01466
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