《自然》刊登南京大學(xué)戈惠明、譚仁祥和梁勇團(tuán)隊(duì)研究成果：自然界中首例催化[6+4]環(huán)加成反應(yīng)的酶
周環(huán)反應(yīng)是一類在反應(yīng)過程中形成環(huán)狀過渡態(tài)的協(xié)同反應(yīng)，比如著名的[4+2]環(huán)加成反應(yīng)（Diels-Alder反應(yīng)）、Cope-重排反應(yīng)、Claisen-重排反應(yīng)等，這些反應(yīng)在有機(jī)合成中有著廣泛的應(yīng)用。有意思的是，在自然界中也觀察到了可催化這些著名周環(huán)反應(yīng)的酶。早在1965年，Woodward和Hoffmann兩位諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者就預(yù)測了[6+4]或其它高階環(huán)加成反應(yīng)可以發(fā)生，隨后在有機(jī)合成中確實(shí)觀察到了[6+4]反應(yīng)，但自然界中是否存在著可催化[6+4]反應(yīng)的酶仍然是個(gè)謎。???
南京大學(xué)戈惠明、譚仁祥和梁勇研究團(tuán)隊(duì)首次鑒定出能夠催化[6+4]環(huán)加成反應(yīng)的一類酶家族，相關(guān)成果“Enzyme-catalysed [6+4] cycloadditions in the biosynthesis of natural products”2019年3月13日在線發(fā)表在英國《自然》雜志上。南京大學(xué)助理研究員張博博士、以及博士研究生王凱標(biāo)、王文和汪欣為該論文共同第一作者。戈惠明、譚仁祥、梁勇以及加州大學(xué)洛杉磯分校的Kendall N. Houk教授為共同通訊作者。
該團(tuán)隊(duì)在前期工作中，從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有抗幽門螺旋桿菌活性的新穎大環(huán)內(nèi)酯化合物命名為streptoseomycin，根據(jù)其結(jié)構(gòu)推斷，它在微生物體內(nèi)的合成過程中可能涉及[4+2]環(huán)加成反應(yīng)。為鑒定此過程，他們比較分析了streptoseomycin以及其結(jié)構(gòu)類似物nargenicin的生物合成基因簇，推測一個(gè)未知功能的同源蛋白StmD、NgnD很有可能分別負(fù)責(zé)streptoseomycin和nargenicin中的環(huán)化反應(yīng)。然而，敲除stmD?基因并未得到預(yù)料中的環(huán)化產(chǎn)物前體3?，而得到了線性化合物4?和5?，這很可能是化合物3?環(huán)內(nèi)雙鍵較多，張力較大，自發(fā)水解開環(huán)所致。研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)在微生物體內(nèi)驗(yàn)證StmD功能的實(shí)驗(yàn)，首先敲除了基因簇上大部分基因，僅留下聚酮合成酶基因，此突變株只產(chǎn)生化合物4?；當(dāng)將stmD?基因回補(bǔ)回去時(shí)，得到了化合物6??8?，其中化合物7?不穩(wěn)定，可經(jīng)Cope重排轉(zhuǎn)化成6?。該結(jié)果表明，聚酮合成酶的直接產(chǎn)物是3?，若無下游其它酶存在時(shí)，3?將發(fā)生水解開環(huán)而生成4?；若再引入StmD，則催化發(fā)生周環(huán)反應(yīng)，奇怪的是，該酶不僅催化了[4+2]反應(yīng)，也催化了[6+4]反應(yīng)。???
隨后，研究人員設(shè)計(jì)了兩步串聯(lián)的酶反應(yīng)在體外來驗(yàn)證周環(huán)酶的催化功能。首先，通過聚酮合成酶上的硫酯酶結(jié)構(gòu)域催化鏈狀化合物4?-SNAC環(huán)化形成3?，當(dāng)同時(shí)加入StmD或NgnD時(shí)，反應(yīng)體系中觀察到了化合物6??8?的生成，確證StmD或NgnD可同時(shí)催化[4+2]和[6+4]反應(yīng)。此外研究人員以StmD為探針從公共基因組數(shù)據(jù)庫中，挖掘鑒定出了另外三個(gè)可催化此反應(yīng)的酶。???
為了更好地理解[6+4]、[4+2]環(huán)加成反應(yīng)和[3,3]-Cope重排反應(yīng)之間的相互關(guān)系，研究人員通過密度泛函理論計(jì)算了反應(yīng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)。有趣的是，底物3?越過單一過渡態(tài)后可歧化成兩個(gè)方向，分別生成[6+4]、[4+2]反應(yīng)產(chǎn)物，由于[6+4]化合物在熱力學(xué)上更穩(wěn)定，[4+2]產(chǎn)物可再經(jīng)Cope重排自發(fā)轉(zhuǎn)化成[6+4]產(chǎn)物。此理論計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果相吻合，進(jìn)一步證明了之前的推斷。???
最后，研究者獲得了StmD、NgnD和101015D三個(gè)蛋白的晶體來進(jìn)一步研究該反應(yīng)的催化機(jī)理。通過分子對接、計(jì)算機(jī)模擬和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，闡明了此類新型環(huán)加成酶的反應(yīng)機(jī)制。M69中富含電子的硫原子會特定的指向過渡態(tài)中部分帶正電的雙烯部分，從而產(chǎn)生有利的靜電作用；同時(shí)反應(yīng)物中部分帶負(fù)電的三烯酯會與W67上的芳香環(huán)產(chǎn)生π–π堆疊相互作用，來穩(wěn)定過渡態(tài)并加速整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)行。此外，Y55和Y13也會通過分子間氫鍵和CH–π相互作用來催化反應(yīng)。???
綜上所述，研究人員巧妙設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過體內(nèi)敲除基因、體外酶催化反應(yīng)、量子化學(xué)計(jì)算、分子動(dòng)力學(xué)模擬以及蛋白晶體的研究等，表征了首例可催化[6+4]/[4+2]環(huán)加成反應(yīng)的酶。這類酶的發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步拓展人們對周環(huán)反應(yīng)酶的認(rèn)識，啟發(fā)科學(xué)家們將來利用和改造周環(huán)反應(yīng)酶來實(shí)現(xiàn)有價(jià)值的分子轉(zhuǎn)化。???
該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，國家自然科學(xué)基金委優(yōu)青項(xiàng)目、重點(diǎn)項(xiàng)目，中組部青年海外高層次人才計(jì)劃，江蘇省特聘教授計(jì)劃等的資助，特別感謝南京大學(xué)配位化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，以及人工微結(jié)構(gòu)科學(xué)與技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心高性能計(jì)算中心和南京大學(xué)高性能計(jì)算中心提供的服務(wù)。???
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