生科院戈惠明、譚仁祥團(tuán)隊揭示抗生素Alchivemycin A藥效團(tuán)的生物合成機(jī)制
氧化還原修飾是天然產(chǎn)物生物合成中的重要化學(xué)過程。這一過程可大大提高天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，提升天然產(chǎn)物的生物活性、增加水溶性等作用。氧化還原修飾是由一系列氧化還原酶所介導(dǎo)的，比如：細(xì)胞色素P450、α-酮戊二酸依賴的氧化酶，NAD(P)H/NAD(P)+以及黃素等依賴的氧化還原酶等。這些氧化/還原酶介導(dǎo)的天然產(chǎn)物的化學(xué)修飾甚至骨架的重排，大大豐富了天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性。因此，闡明天然產(chǎn)物合成過程中氧化還原酶所扮演的角色，對于其后續(xù)的成藥性研究以及發(fā)展新型的生物催化工具具有重要的意義。
近期，南京大學(xué)戈惠明和譚仁祥課題組闡釋了Alchivemycin A（AVM，1）生物過程中的氧化還原次級代謝網(wǎng)絡(luò)，包括AVM關(guān)鍵藥效團(tuán)的形成及自抗性研究。相關(guān)工作“Redox Modifications in the Biosynthesis of Alchivemycin A Enable the Formation of Its Key Pharmacophore”發(fā)表在J. Am. Chem. Soc.上。
AVM是日本科學(xué)家從植物內(nèi)生放線菌Streptomyces?sp. TP-A0867中分離得到的復(fù)雜多環(huán)聚酮化合物，具有強(qiáng)勁的抗菌活性。AVM具有罕見的2H-四氫-4,6-二氧代-1,2-惡嗪（TDO）環(huán)系統(tǒng)，以及包括兩個環(huán)氧環(huán)在內(nèi)的眾多氧化后修飾。然而，至今AVM生物合成的氧化還原后修飾過程特別是獨(dú)特惡嗪環(huán)的形成過程以及其抗菌機(jī)制，未有報道。
在這項研究中，作者闡明了一種涉及六種氧化還原酶催化AVM形成的氧化還原代謝網(wǎng)絡(luò)。作者通過體內(nèi)基因敲除，體外生化分析和一鍋酶法合成來表征了這種復(fù)雜的氧化還原網(wǎng)絡(luò)。突變株中得到的前體化合物2可以相對無序的經(jīng)FAD依賴的單加氧酶（AvmO1，AvmO2，AvmO3），F420依賴的氧化還原酶（AvmR），α-KG/Fe2+依賴的雙加氧酶（AvmO4）以及P450（AvmP）作用，通過12條不同的路徑網(wǎng)絡(luò)化生成AVM（圖-1，2，3）。首先，2可以經(jīng)過AvmR，AvmO2，AvmO3作用分別將C25位的羰基還原為羥基，以及形成C14-C15位和C11-C12位的環(huán)氧環(huán)，這3個酶的催化并沒有先后之分，但最終都匯聚生成化合物9。中間體9隨后依次經(jīng)AvmP（C24位羥基化）、AvmO1（TDO環(huán)形成）和AvmO4（C22位羥基化）作用形成終產(chǎn)物AVM（圖-1，紅色箭頭，路徑a）。另外，化合物10也可以經(jīng)AvmP、AvmO1、AvmO4和AvmO3催化得到AVM（圖-1，藍(lán)色箭頭，路徑b），其中路徑b中的8，10，15又可以通過AvmO3匯聚到路徑a中，最終以一種氧化還原網(wǎng)絡(luò)的形式生成AVM（圖-1）。最后，作者以化合物2為底物，在體外用6個酶重構(gòu)了AVM的生成（圖-3F）。
更重要的是，作者發(fā)現(xiàn)并闡明了FAD依賴的單加氧酶AvmO1催化酰胺鍵上C-N間的插氧形成AVM中的TDO環(huán)，這與Bayer-Villiger單加氧酶（BVMOs）催化的反應(yīng)十分相似，并且氧標(biāo)記實驗也證實AvmO1催化的反應(yīng)過程可能與Bayer-Villiger氧化一致（圖-3）。但之前報道的BVMO未見有C-N間插氧的報道，這可能代表了黃素氧化酶一種前所未有的催化功能。
在隨后的活性測試中作者還發(fā)現(xiàn)，TDO環(huán)對于AVM的抗菌活性至關(guān)重要，在將編碼負(fù)責(zé)RNA聚合酶β亞基合成的基因avmK導(dǎo)入AVM敏感菌株Streptomyces?sp. 120454后發(fā)現(xiàn)，AVM對其生長不再產(chǎn)生影響（圖-4）。這表明AVM可以靶向性與RNA聚合酶的β亞基相互作用產(chǎn)生抗菌活性，而微生物自身通過靶標(biāo)修飾賦予AVM自抗性。這反映了一種微生物在應(yīng)對環(huán)境變化與生存競爭過程中有意思的進(jìn)化過程，首先通過自身酶修飾產(chǎn)生含TDO環(huán)的抑菌化合物，抑制其他微生物生長以保證自身獲得更充足的生存空間，然后將自身的RNA聚合酶β亞基（即抑菌分子的作用靶點(diǎn)）突變產(chǎn)生自抗性而不受影響。
圖-4、AVM及類似物的活性及自抗性研究，A，B）AVM及類似物對Micrococcus luteus的作用效果，C，D，E）AVM對S.?sp. 120454野生型及導(dǎo)入不同基因后菌株的作用效果
綜上，本論文通過一系列體內(nèi)，體外生化實驗闡明了AVM的生物合成過程，其中包括一個前所未有的FAD依賴的單加氧酶催化的C-N間的插氧，且其介導(dǎo)形成的TDO環(huán)是AVM發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵藥效基團(tuán)。同時定位到了AVM抗菌的作用靶點(diǎn)RNA聚合酶β亞基及其自抗性基因avmK。本文的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了黃素氧化酶的功能范圍，并為基于AVM的抗菌化合物和生物催化劑開發(fā)提供了更多見解。
南京大學(xué)博士研究生朱宏杰為文章第一作者，戈惠明教授和譚仁祥教授為文章共同通訊作者，南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室為第一單位。
該項研究工作得到國家杰出青年基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃等項目的資助。
文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c00516
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