開(kāi)啟RNAi治療新時(shí)代：南京大學(xué)團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建體內(nèi)自組裝的新一代siRNA遞送及基因治療技術(shù)
基因異常表達(dá)及突變引起的疾病往往不能夠被傳統(tǒng)藥物所治愈，有效的基因表達(dá)干預(yù)成為治療這類(lèi)疾病的唯一方法。RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)之后，該技術(shù)迅速被科研人員應(yīng)用于疾病治療領(lǐng)域，使基因治療的發(fā)展迎來(lái)了巨大的契機(jī)。該技術(shù)通過(guò)導(dǎo)入小干擾RNA（siRNA）特異性抑制致病靶向基因的表達(dá)，起到治療疾病的作用。遺憾的是，雖然RNAi技術(shù)讓人們看到了基因治療的曙光，但是siRNA的體內(nèi)遞送問(wèn)題一直阻礙著RNAi技術(shù)的臨床應(yīng)用。如何讓siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定傳輸，能否找到一種安全、可靠、與機(jī)體高度兼容的遞送載體，一直是RNAi轉(zhuǎn)化應(yīng)用的核心科學(xué)問(wèn)題。
南京大學(xué)張辰宇團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可以包裹小RNA（miRNA和siRNA）到外泌體并將外泌體分泌到細(xì)胞外；分泌的小RNA隨后會(huì)被受體細(xì)胞攝取，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中的基因表達(dá)。由于外泌體是細(xì)胞自身分泌的囊泡，與其他載體相比，其具有低免疫源性和低毒性的特點(diǎn)，是一種良好的小RNA天然載體。因此很多研究人員迅速開(kāi)始著手嘗試?yán)猛饷隗w遞送siRNA。在傳統(tǒng)的基于外泌體的siRNA遞送策略中，siRNA需要在體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與外泌體進(jìn)行預(yù)組裝，然后通過(guò)超速離心等技術(shù)從培液上清中分離純化細(xì)胞分泌的、包裹好siRNA的外泌體，從而得到外泌體siRNA并進(jìn)行體內(nèi)注射。該方法成本較高，過(guò)程復(fù)雜不易控制，分離得到的外泌體難以達(dá)到臨床需求，限制了其大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用。
2021年3月29日，南京大學(xué)張辰宇/陳熹/閆超/李菁團(tuán)隊(duì)在Cell Research?發(fā)表論文“Invivo self-assembled small RNAs as a new generation of RNAi therapeutics”，建立了新一代的siRNA遞送及基因治療技術(shù)，基于體內(nèi)自組裝外泌體siRNA的策略，實(shí)現(xiàn)siRNA從表達(dá)到裝載再到遞送的全體內(nèi)自動(dòng)化過(guò)程。該技術(shù)利用合成生物學(xué)設(shè)計(jì)理念，通過(guò)向小鼠靜脈注射可表達(dá)siRNA和外泌體膜表面靶向肽段的合成生物學(xué)基因環(huán)路（以質(zhì)粒DNA的形式），將小鼠的肝臟重構(gòu)成可以產(chǎn)生和分泌siRNA的器官，繼而利用機(jī)體自身的外泌體體內(nèi)傳輸途徑，實(shí)現(xiàn)siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定、高效、安全的傳輸。利用該策略，研究人員成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肥胖三種疾病的靶基因干預(yù)，達(dá)到了顯著的治療效果。
首先，研究人員在體外構(gòu)建了可以表達(dá)siRNA的基因環(huán)路，該基因環(huán)路可靈活的實(shí)現(xiàn)多個(gè)siRNA和靶向肽段的插入。通過(guò)靜脈注射將基因環(huán)路導(dǎo)入體內(nèi)，結(jié)果顯示，基因環(huán)路主要被肝臟攝取。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示基因環(huán)路可在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并指導(dǎo)肝細(xì)胞自動(dòng)生產(chǎn)siRNA及自組裝siRNA進(jìn)入外泌體，自組裝的外泌體siRNA進(jìn)而隨血液循環(huán)進(jìn)入肺、腎等多個(gè)組織器官。基于此，研究人員在LLC原位移植瘤肺癌模型和KRAS突變的原發(fā)肺癌模型中，證實(shí)了靶向EGFR和KRAS的siRNA可以被高效遞送到肺腫瘤組織并有效降低靶基因的表達(dá)，顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)了小鼠的生存期。
另一方面，通過(guò)在基因環(huán)路中插入與外泌體膜表面蛋白相融合的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的肽段（狂犬病毒肽段RVG），可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)自組裝產(chǎn)生靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的攜帶siRNA的外泌體。結(jié)果顯示通過(guò)該復(fù)合基因環(huán)路體內(nèi)自組裝而成的外泌體siRNA可以高效的穿過(guò)血腦屏障，將siRNA遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。研究人員通過(guò)遞送兩個(gè)靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤致病基因（EGFR和TNC）的siRNA，顯著緩解了顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了小鼠的生存期。進(jìn)一步，通過(guò)向下丘腦遞送靶向PTP1B（該基因敲除小鼠抵抗高脂誘導(dǎo)的肥胖）的siRNA，可同時(shí)恢復(fù)肥胖小鼠的瘦素敏感性和胰島素敏感性，增加小鼠的能量代謝，起到緩解肥胖的效果。
綜上，該研究闡述了一種劃時(shí)代的siRNA遞送及基因治療技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：（1）利用宿主自己的器官分泌的外泌體為載體，完全解決了siRNA遞送載體帶來(lái)的免疫源性和毒性問(wèn)題；（2）通過(guò)對(duì)基因環(huán)路的靈活編輯，可同時(shí)傳輸多個(gè)siRNA，對(duì)疾病進(jìn)行多靶點(diǎn)打擊；（3）特異性的靶向肽段可高效的將siRNA輸送到特定的組織，克服血腦屏障等生物屏障的制約。由于該技術(shù)使用的合成生物學(xué)基因環(huán)路的本質(zhì)是質(zhì)粒，其設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和應(yīng)用均非常簡(jiǎn)單，因此利于該技術(shù)的迅速推廣和拓展，將極大促進(jìn)RNAi治療的發(fā)展，具有重大的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值，有望成為RNAi治療領(lǐng)域的里程碑，開(kāi)啟基因治療的新篇章。
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