韓家淮課題組利用SWATH-MS研究LPS通路中復(fù)合物的動(dòng)態(tài)變化
2019年3月10號(hào)，細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院韓家淮課題組在Molecular & Cellular Proteomics雜志發(fā)表了題為“Quantification of dynamic protein interactions and phosphorylation in LPS signaling pathway by SWATH-MS”的研究論文，本文用SWATH-MS定量質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)性地研究了LPS信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白TRAF6、MyD88和NEMO復(fù)合物中的動(dòng)態(tài)蛋白相互作用和磷酸化，揭示了在LPS刺激下Myddosome復(fù)合物中IRAK家族蛋白存在不同的招募速度。
LPS（脂多糖）是細(xì)菌細(xì)胞膜外膜一個(gè)主要的成分，其會(huì)被哺乳細(xì)胞的受體TLR4識(shí)別，并激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放。LPS/TLR4信號(hào)通路已經(jīng)研究多年，其中大部分關(guān)鍵的作用蛋白已經(jīng)被鑒定，但是仍有一些問題尚未解決，比如復(fù)合物的動(dòng)態(tài)組裝是如何實(shí)現(xiàn)以及復(fù)合物中關(guān)鍵作用蛋白相對(duì)比例是多少。為了解決這些問題，我們擬利用SWATH-MS技術(shù)去定量分析LPS信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白復(fù)合物。為了純化蛋白復(fù)合物，我們分別建立了Flag-knockin TRAF6、Flag-knockin MyD88和在NEMO敲除細(xì)胞中回補(bǔ)Flag-NEMO這三株RAW 264.7細(xì)胞系。我們利用LPS分別處理這三株細(xì)胞系十個(gè)時(shí)間點(diǎn)，然后用免疫親和純化(immunoprecipitation)的方法獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物，并用SWATH-MS分析這些樣品。
我們?cè)?/span>30-40個(gè)IP樣品中定量到2500-3000個(gè)蛋白，除此以外，我們?cè)谶@些樣品中鑒定到2000個(gè)左右的磷酸化位點(diǎn)。從這些定量數(shù)據(jù)中，我們成功地獲得了所有的已知LPS信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的動(dòng)態(tài)變化信息。SWATH-MS結(jié)果顯示，IRAK家族蛋白在招募到MyD88上時(shí)，有明顯的時(shí)間先后之分，且與現(xiàn)有的報(bào)道不同。我們還分析了Myddosome中關(guān)鍵蛋白TIRAP和MyD88的比列，顯示MyD88:TIRAP約為5:1，表明MyD88在復(fù)合物中以多聚的形式存在。此外，我們還鑒定到關(guān)鍵蛋白上的一系列磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)NEMO上一個(gè)未報(bào)道的磷酸化位點(diǎn)，此位點(diǎn)的突變會(huì)影響NEMO激活NF-kB的能力。
綜上，該研究系統(tǒng)地分析了LPS中蛋白復(fù)合物中關(guān)鍵蛋白動(dòng)態(tài)變化和蛋白間的比例，且鑒定了一系列未報(bào)道的磷酸化位點(diǎn)，為后續(xù)的LPS信號(hào)通路研究提供了豐富的資源。
廈門大學(xué)博士后吳秀榕為文章的第一作者，通訊作者為韓家淮教授和鐘傳奇副教授。
原文鏈接：https://www.mcponline.org/content/early/2019/03/07/mcp.RA119.001380
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