Cell | 張澤民課題組與合作者揭示肝癌免疫微環(huán)境的動態(tài)特征
2019年10月31日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學(xué)學(xué)院、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）張澤民課題組聯(lián)合首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院彭吉潤課題組以及德國藥企勃林格殷格翰公司多位科學(xué)家，在國際期刊Cell上發(fā)表了題為Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma的研究論文，結(jié)合10x Genomics和SMART-seq2兩種單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，對肝癌患者多個組織的免疫細(xì)胞做出了系統(tǒng)性的刻畫，分析了免疫細(xì)胞動態(tài)遷移和狀態(tài)轉(zhuǎn)化的特征，探索了它們在肝癌治療上的潛在價(jià)值。
【研究思路】
目前單細(xì)胞測序技術(shù)已經(jīng)成為探究細(xì)胞類群多樣性的常用技術(shù)手段，而不同的測序技術(shù)在細(xì)胞捕獲和基因捕獲效率上具有各自不同的優(yōu)勢。例如，目前常用的10x Genomics測序技術(shù)利用基于微滴包被的原理，可實(shí)現(xiàn)一次實(shí)驗(yàn)獲得較多的細(xì)胞數(shù)量，有效降低了單細(xì)胞測序的實(shí)驗(yàn)成本；而SMART-seq2測序技術(shù)則利用孔板對單個細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通量相對較低，但每個細(xì)胞的基因捕獲率相對較高。因此，本研究結(jié)合了SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3’兩種單細(xì)胞測序技術(shù)，并整合這兩種平臺的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，充分發(fā)揮不同數(shù)據(jù)類型的優(yōu)勢，獲得高分辨率的肝癌免疫圖譜。
癌旁組織和外周血是腫瘤相關(guān)研究中常用的對照組織，而其他相關(guān)的免疫器官或病理組織則較少受到關(guān)注。例如，腹水是肝癌患者常見的病理現(xiàn)象，其產(chǎn)生與肝癌預(yù)后不良有關(guān)，然而腹水中的免疫細(xì)胞組成及其與肝癌的聯(lián)系尚不清楚。因此，本研究收集肝癌病人的癌組織、癌旁組織、淋巴結(jié)、外周血和腹水五種組織的CD45+免疫細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并分析肝癌免疫微環(huán)境中的細(xì)胞類型、表達(dá)特征，以及不同組織之間細(xì)胞的動態(tài)變化與聯(lián)系。
圖1 課題總體設(shè)計(jì)
【主要發(fā)現(xiàn)】
1. 不同組織的免疫組成有較大差異，腫瘤中的巨噬細(xì)胞構(gòu)成腹水中髓系細(xì)胞的主要來源
整合兩種單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，研究人員刻畫了高分辨率的肝癌免疫圖譜，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和髓系細(xì)胞等主要細(xì)胞類群以及主要類群下屬的40類細(xì)胞亞群。這些細(xì)胞亞群在不同組織中呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞類型富集特征，其中腹水中的細(xì)胞類型呈現(xiàn)明顯的特異性。
為探究腹水中細(xì)胞的潛在起源，研究者將腹水中的免疫細(xì)胞與其他組織中的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)比對，發(fā)現(xiàn)腹水中的淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞來源明顯不同，淋巴細(xì)胞與外周血細(xì)胞有明顯的相似性，而髓系細(xì)胞主要定位于腫瘤組織細(xì)胞。隨后，通過前沿的生物信息學(xué)分析方法RNA velocity和基于線粒體突變的進(jìn)化樹構(gòu)建，研究者對巨噬細(xì)胞從腫瘤到腹水的遷移過程進(jìn)行了確認(rèn)。
2. 腫瘤中的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)兩種不同的狀態(tài)(TAM-like和MDSC-like)
通過與其他數(shù)據(jù)中的巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組對應(yīng)，研究者發(fā)現(xiàn)肝癌腫瘤中的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)兩種不同的狀態(tài)：TAM-like和MDSC-like狀態(tài)。生存分析表明，前者的特征基因與預(yù)后不良有關(guān)，其表達(dá)的兩個關(guān)鍵基因SLC40A1和GPNMB也與預(yù)后不良有關(guān)。通過CRISPR技術(shù)在THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)這兩個基因在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起重要作用。
3. 腫瘤中的LAMP3+ DC是成熟態(tài)的DC，具有向肝淋巴結(jié)遷移和與多種淋巴細(xì)胞相互作用的潛在能力
腫瘤微環(huán)境中的樹突狀細(xì)胞，傳統(tǒng)上分為cDC1和cDC2，而本研究鑒定出一群特點(diǎn)突出的DC，即LAMP3+ DC。這群DC與cDC1和cDC2在表達(dá)特征上有較大的差別，主要表達(dá)CD80, CD83, CCR7等與成熟和細(xì)胞遷移有關(guān)的基因。而且這一類樹突狀細(xì)胞不僅存在于肝癌中，也存在于乳腺癌和肺癌中。隨后，研究者通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LAMP3+ DC是成熟態(tài)的DC，且具有較高的遷移能力。通過前沿的生物信息學(xué)分析方法RNA velocity和基于線粒體突變的進(jìn)化樹構(gòu)建，研究者發(fā)現(xiàn)LAMP3+ DC可能同時起源于cDC1和cDC2，且具有向肝淋巴結(jié)遷移的潛在能力。
圖2 左圖：將肝癌組織中樹突狀細(xì)胞的RNA velocity的計(jì)算結(jié)果投射到在Diffusion Map坐標(biāo)上，顏色代表不同的細(xì)胞群。右圖：基于線粒體基因突變構(gòu)建的LAMP3+ DC進(jìn)化樹
腫瘤浸潤性的LAMP3+ DC發(fā)揮了廣泛調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的作用，它們與T細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)的配體-受體相互作用數(shù)量最多。LAMP3+ DC通過CCL19-CCR7和CCL22-CCR4吸引T細(xì)胞，并通過CD86-CD28作用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群，通過CD86-CTLA4作用于耗竭性T細(xì)胞亞群。研究者通過多色免疫組化對表達(dá)PD-1的T細(xì)胞與表達(dá)PD-L1的LAMP3+ DC進(jìn)行了空間位置的判斷，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)出相鄰的位置，為其相互作用提供了另一角度的證據(jù)。然而，LAMP3+ DC在腫瘤中的作用與功能仍需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。
【討論】
本項(xiàng)研究首次對肝癌臨床樣本進(jìn)行包括病理組織在內(nèi)的多組織位點(diǎn)的收集，并利用前沿的生物信息學(xué)分析方法，通過自體對照，不僅描述了肝癌微環(huán)境的免疫組分和狀態(tài)，而且描繪了腫瘤浸潤免疫細(xì)胞跨組織的動態(tài)過程。此項(xiàng)國際領(lǐng)先的開創(chuàng)性工作，可為人們研究肝癌和其他疾病中的免疫細(xì)胞，以及開發(fā)新的臨床檢測與治療方案提供新的思路。例如，論文的共同第一作者何堯指出，聯(lián)合使用具有不同優(yōu)勢的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞異質(zhì)性的研究或可成為相關(guān)研究的范式策略之一。研究揭示了腫瘤中的巨噬細(xì)胞構(gòu)成腹水中髓系細(xì)胞的主要來源。由于外周血的免疫特征與腫瘤中具有較大差異，而組織活檢的取樣難度相對較大，該結(jié)果為利用肝癌病人的腹水代替外周血或活檢組織進(jìn)行腫瘤狀態(tài)檢測提供了新的思路。針對巨噬細(xì)胞中與較差預(yù)后相關(guān)的基因GPNMB和SLC40A1，研究者通過揭示其在巨噬細(xì)胞中的炎癥作用，為相關(guān)藥物治療提供了潛在靶點(diǎn)。而研究發(fā)現(xiàn)的LAMP3+樹突狀細(xì)胞，可從腫瘤遷移到周淋巴結(jié)，表達(dá)多種免疫配體基因，并具有與多種T淋巴細(xì)胞類型相互作用的潛力。這為后續(xù)進(jìn)一步對該細(xì)胞類型進(jìn)行研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，提出了通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境進(jìn)行腫瘤治療的可能性，并為基于樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞療法提供了新的思路和依據(jù)。
北京大學(xué)BIOPIC和生命科學(xué)學(xué)院博士生張啟明、北京大學(xué)前沿交叉學(xué)院博士生何堯和北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院（北京世紀(jì)壇醫(yī)院）博士生羅楠為該論文的并列第一作者，北京大學(xué)BIOPIC和生命科學(xué)學(xué)院任仙文副研究員、張澤民教授、勃林格殷格翰公司主任科學(xué)家劉康博士和北京世紀(jì)壇醫(yī)院彭吉潤教授為該論文的共同通訊作者。該課題得到了自然科學(xué)基金和北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心的資助，以及北大高通量測序平臺的協(xié)助與支持。
原文鏈接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31119-5
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