任國(guó)棟團(tuán)隊(duì)揭示HYL1拮抗外切體調(diào)控miRNA加工生成新機(jī)制
7月7日，我院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室任國(guó)棟研究員課題組在《美國(guó)科學(xué)院院刊》（PNAS）上發(fā)表了題為《雙鏈RNA結(jié)合蛋白HYL1保護(hù)miRNA前體分子免受核內(nèi)外切體攻擊》“Hyponastic Leaves 1 protects pri-miRNAs from nuclear exosome attack”的研究論文。該研究揭示了擬南芥雙鏈RNA結(jié)合蛋白 HYL1在 miRNA加工成熟過(guò)程中保護(hù)底物分子（pri-miRNA及其加工過(guò)程中間產(chǎn)物）免受核酸外切體（exosome）攻擊的新機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)HYL1可能在DCL1介導(dǎo)的由環(huán)到基部（Loop-to-base）和基部到環(huán)（Base-to-loop）成熟的pri-miRNAs 加工過(guò)程中發(fā)揮不同作用。
miRNA是一類長(zhǎng)度在20-24堿基的內(nèi)源小分子RNA，在動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)決定和轉(zhuǎn)換、以及環(huán)境應(yīng)答等幾乎所有生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（稱為pri-miRNA）可以折疊成莖區(qū)不完全配對(duì)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可被RNase III家族核酸內(nèi)切酶識(shí)別并切割后釋放出成熟的雙鏈miRNA/miRNA*。和動(dòng)物相比，植物 pri-miRNA的莖環(huán)區(qū)長(zhǎng)度變異更大（從60 nt到超過(guò)500 nt，動(dòng)物中一般為~70 nt），從而增加了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。因此植物除了經(jīng)典的基部到環(huán)的加工方式，不少miRNA以環(huán)到基部的切割方式成熟，有些長(zhǎng)的pri-miRNA還存在兩次以上的連續(xù)切割 (圖1)。
圖1、植物miRNA的兩種加工機(jī)制（Bologna and Voinnet, 2014 ）
在植物中，DCL1在HYL1和鋅指蛋白SE等的幫助下負(fù)責(zé)絕大多數(shù)miRNA的加工成熟。HYL1被認(rèn)為是DCL1最重要的伴侶分子，推測(cè)其在miRNA加工過(guò)程中的功能類似于動(dòng)物miRNA生成中Drosha的伴侶蛋白DGCR8和Dicer的伴侶蛋白TRBP。已有的研究表明HYL1有助于提高DCL1加工的效率和準(zhǔn)確性，但其具體的作用機(jī)制以及HYL1是否還有其他生物學(xué)功能仍不清楚。
外切體是生物體最主要的負(fù)責(zé)各類RNA降解的蛋白質(zhì)機(jī)器，在rRNA加工成熟、正常RNA周轉(zhuǎn)降解以及非正常RNA（如錯(cuò)誤轉(zhuǎn)錄本、RNA加工副產(chǎn)物、靶基因切割產(chǎn)物等）的及時(shí)清除等細(xì)胞基本生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。外切體核心復(fù)合物共含9個(gè)蛋白（Exosome 9，exo9），在古菌和真核生物中高度保守。核心復(fù)合物通過(guò)與不同輔助因子互作參與不同RNA底物的識(shí)別和降解。根據(jù)亞細(xì)胞定位的不同，外切體可分為胞質(zhì)外切體與核內(nèi)外切體，核內(nèi)外切體又分為核仁外切體與核質(zhì)外切體。RNA解旋酶SKI2、MTR4以及HEN2分別是胞質(zhì)外切體、核仁外切體與核質(zhì)外切體的重要輔助成員。
該研究通過(guò)正向遺傳學(xué)篩選hyl1-2的表型抑制子，結(jié)合圖位克隆分離鑒定到核質(zhì)外切體的另一輔助因子SOP1。SOP1蛋白C端含有5個(gè)串聯(lián)的CCCH型鋅指結(jié)構(gòu)，可能與RNA結(jié)合有關(guān)。SOP1與HEN2共定位，參與部分核質(zhì)外切體靶標(biāo)RNA的降解。在hyl1-2中引入HEN2的突變同樣可以顯著抑制hyl1-2的發(fā)育缺陷，表明SOP1和HEN2很可能是通過(guò)外切體途徑參與miRNA調(diào)控的 (圖2A)。通過(guò)對(duì)miRNA以及pri-miRNA的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，hyl1 sop1 雙突變體中加工方向?yàn)榄h(huán)到基部的pri-miRNA較hyl1有更高的積累，對(duì)應(yīng)成熟miRNA表達(dá)水平得到了顯著回復(fù)，表明SOP1選擇性參與hyl1突變體中加工方向?yàn)榄h(huán)到基部的pri-miRNA降解（圖2B&C）。令人驚訝的是，hyl1 hen2雙突變體中幾乎所有的pri-miRNA均顯著累積，但是只有環(huán)到基部成熟的miRNA得到了回復(fù)（圖2B&C）。該研究結(jié)果表明當(dāng)HYL1缺失時(shí)，環(huán)到基部加工的pri-miRNA的更多累積可以促進(jìn)miRNA的生成，而基部到環(huán)加工的pri-miRNA則不能。加工復(fù)合體成員SE能夠與HEN2相互作用，猜測(cè)可能在招募外切體中發(fā)揮功能。
圖2、HYL1拮抗核內(nèi)外切體，確保pri-miRNA加工順利進(jìn)行。
綜上，該研究揭示了外切體在pri-miRNA生物發(fā)生中的監(jiān)控作用以及加工復(fù)合體核心成員HYL1的保護(hù)功能，拓展了我們對(duì)于加工過(guò)程中pri-miRNA質(zhì)量控制機(jī)制的認(rèn)識(shí)。此外，該研究還系統(tǒng)鑒定了受HEN2、SOP1影響的差異表達(dá)基因，這些基因可作為核質(zhì)外切體功能的標(biāo)志基因。
任國(guó)棟課題組博士后高帥（現(xiàn)工作于廣東省生物工程研究所）、博士研究生王鏡諭以及生命學(xué)院姜寧青年副研究員為本文的共同第一作者，任國(guó)棟研究員為通訊作者，復(fù)旦大學(xué)為第一單位。遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室常芳教授、王應(yīng)祥教授以及蒯本科教授團(tuán)隊(duì)參與了本項(xiàng)目的研究；晶能生物技術(shù)(上海)有限公司提供了測(cè)序方面的技術(shù)支持。該研究受國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目資助。
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https://doi.org/10.1073/pnas.2007203117
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