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由于光學(xué)衍射極限(Abbe?diffraction limit)的限制，傳統(tǒng)的遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡不能夠提供小于其觀察波長(zhǎng)一半尺寸(通常為200-300 nm)的結(jié)構(gòu)信息。為了突破這一物理極限，實(shí)現(xiàn)納米級(jí)甚至分子級(jí)別的成像分辨率，近年來(lái)逐漸發(fā)展了超分辨成像技術(shù)。借助于特異性的超分辨熒光探針,這項(xiàng)技術(shù)可以標(biāo)記（單色）和區(qū)分（多色）蛋白等生物大分子,并在高分辨率尺度下揭示活細(xì)胞內(nèi)活性分子的動(dòng)態(tài)生理過(guò)程，現(xiàn)已成為觀測(cè)細(xì)胞或組織超微結(jié)構(gòu)和揭示細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相互作用的重要方法。

但是，該技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展一直受限于熒光染料的亮度和穩(wěn)定性。相比于傳統(tǒng)光學(xué)成像，超分辨熒光成像建立在更大規(guī)模的光子統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上。為了進(jìn)一步提升成像分辨率、改善成像質(zhì)量，人們希望設(shè)計(jì)出具有更高亮度以及更好光穩(wěn)定性的熒光染料。

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圖1季銨化哌嗪羅丹明-提升亮度的新型超分辨熒光染料

近期，大連理工大學(xué)精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室肖義教授課題組與合作者新加坡科技設(shè)計(jì)大學(xué)的劉曉剛教授課題組發(fā)展了一種季銨化哌嗪的新策略。如圖1所示，該策略通過(guò)將具有吸電子效應(yīng)的季銨基團(tuán)連接在供體芳香胺上，降低了胺基的整體供電子能力，使得羅丹明染料的激發(fā)態(tài)扭轉(zhuǎn)(TICT)態(tài)更不穩(wěn)定，從而有效抑制TICT態(tài)的形成。實(shí)驗(yàn)表明，季銨化哌嗪羅丹明分子具有更好的單分子亮度及更多的總收集光子數(shù)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的單分子定位超分辨成像潛力。作者運(yùn)用標(biāo)記有季銨化哌嗪羅丹明的抗體進(jìn)行了微管標(biāo)記的超分辨成像(圖1右)，展示了季銨化哌嗪羅丹明在定位型成像中可以提供更高的定位密度和更好的定位型超分辨成像的能力。

為了在活細(xì)胞水平上驗(yàn)證季銨化哌嗪羅丹明染料的成像優(yōu)勢(shì)，作者開(kāi)發(fā)了兩種針對(duì)亞細(xì)胞器標(biāo)記的探針，即細(xì)胞膜探針(Mem-R)和溶酶體探針(Lyso-R)。兩種染料在成像條件下，均在活細(xì)胞靶標(biāo)位置展現(xiàn)出閃爍的單分子信號(hào)特征?；谶@些閃爍的單分子信號(hào)，成功地對(duì)活細(xì)胞的細(xì)胞膜和溶酶體進(jìn)行了定位型超分辨成像（圖2）。最后，為了更進(jìn)一步地說(shuō)明季銨化哌嗪策略的可拓展性，還開(kāi)發(fā)了萘酰亞胺和NBD染料的衍生物。這些結(jié)果證實(shí)了季銨化哌嗪策略改善推拉結(jié)構(gòu)染料的通用性，并為未來(lái)開(kāi)發(fā)具有高亮度的、可適用于超分辨成像的熒光染料提供了很好的指導(dǎo)。

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圖2 季銨化哌嗪羅丹明探針用于細(xì)胞膜和溶酶體的定位型超分辨成像

相關(guān)研究成果發(fā)表在J. Am. Chem. Soc.?2019, 141, 14491上，大連理工大學(xué)博士研究生葉智偉，大連理工大學(xué)精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工程師楊薇，新加坡科技設(shè)計(jì)大學(xué)王超博士和大連理工大學(xué)博士研究生鄭瑩為文章的共同第一作者。該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和大連理工大學(xué)的大力支持。

大連理工大學(xué)精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室肖義教授課題組一直致力于通過(guò)分子設(shè)計(jì)提升熒光染料的超分辨成像能力。將羅丹明染料衍生具有DNA雙鏈大分子靶向功能的Hoechst標(biāo)記基團(tuán)，成功完成了對(duì)活細(xì)胞的細(xì)胞核DNA的定位型超分辨成像(Chem. Commun., 2018, 54, 2842)。近期，該課題組還發(fā)展了一種將羧基引入羅丹明螺環(huán)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)策略，提升了羅丹明螺內(nèi)酰亞胺染料的亮態(tài)壽命，并成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)線粒體、細(xì)胞核組蛋白以及微管結(jié)構(gòu)的光激活超分辨成像(J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 6527)。