朱志偉教授團隊在羧酸還原酶改造與設計方面取得新進展
脂肪酸是生物體內合成的單元羧酸，其甘油三酯衍生物（俗稱油或脂肪）是重要的生產和生活資料，除我們熟知的食用油外，甘油三酯也是食品、飼料、生物柴油和油脂化工等行業(yè)的重要原料。其中油脂化工的主要任務是對脂肪酸進行衍生化，所生產的許多油脂化學品可代替石化產品，且品質精良，并廣泛用于家用化學品、個人護理、藥物、橡膠、塑料，油漆和潤滑劑等。
還原脂肪酸為脂肪醇是高值化脂肪酸最重要的衍生反應之一，但由于羧基的化學惰性，脂肪酸需預先激活形成硫脂衍生物才能進行生物還原。典型的脂肪酸硫脂衍生物包括酰基輔酶A（Acyl-CoA）和?；??；d體蛋白（Acyl-ACP），可通過還原酶催化形成脂肪醛和脂肪醇。而羧酸還原酶（Carboxylicacidreductase, CAR）是一類特殊的多功能酶，可直接利用脂肪酸為底物，其腺苷化結構域（Adenylationdomain,Adomain）催化羧酸底物與ATP反應生成?；?AMP中間體，并將?；D移到肽基載體蛋白（Peptidyl carrier protein, PCP）形成共價?；?PCP硫酯中間體，該中間體再經(jīng)還原酶結構域（Reductasedomain，Rdomain）催化還原為脂肪醛。由于羧酸還原酶獨有的特性，在脂肪酸衍生物微生物合成領域有重要的應用前景。
在前期再造酵母細胞工廠合成中鏈脂肪酸的基礎上（Zhu et al. Nature Chemical Biology 2017, 13:360-362;Zhu et al. Nature Catalysis 2020, 3:64-74），針對羧酸還原酶底物特異性差的缺點，為提升該酶選擇性還原中鏈脂肪酸的能力，本研究組合多種蛋白質工程手段對羧酸還原酶進行了改造和設計。包括（1）非理性定向進化，利用羧酸還原酶有利于緩解中鏈脂肪酸細胞毒性這一特點，設計與生長偶聯(lián)的富集手段，對該酶的隨機突變文庫進行篩選，可獲得更好突變體；（2）理性定點突變，通過比較不同酶腺苷化結構域的底物口袋，找到了控制底物鏈長的特定氨基酸殘基I303，突變該氨基酸為大側鏈色氨酸，可使酶的底物口袋變小，催化中鏈脂肪酸的活性增加；（3）半理性設計，針對還原酶結構域中由三個氨基酸殘基（C983–M985）組成的開關序列，采用定點飽和突變加富集篩選，也可獲得活性提高的突變體；（4）結構域替換和增添，針對羧酸還原酶只能特異性催化2e-還原，替換原有還原酶結構域為可催化4e-還原的異源還原酶結構域，沒有取得理想效果，然而增添一套4e-還原的異源還原酶結構域，也可使脂肪醇合成能力提升；（5）部分突變位點的組合，顯示出協(xié)同和疊加效果。本研究設計和改造羧酸還原酶，使其催化轉化中鏈脂肪酸的能力顯著提升，為利用該酶合成中鏈脂肪醇及其衍生物提供了基礎。
該研究由我院朱志偉教授與瑞典查爾姆斯理工大學Jens Nielsen教授（中國工程院外籍院士）、奧地利格拉茨理工大學MargitWinkler博士等合作完成。朱志偉教授在項目提出、實驗設計、數(shù)據(jù)獲取與分析、項目合作協(xié)調等方面均有重要貢獻。相關論文近日發(fā)表在權威綜合類雜志《美國國家科學院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS），瑞典查爾姆斯理工大學胡雅婷博士和朱志偉教授為論文的共同第一作者。
全文鏈接：
Hu Y, Zhu Z, Gradischnig D, Winkler M, Nielsen J, Siewers V: Engineering carboxylic acid reductase for selective synthesis of medium-chain fatty alcohols in yeast. Proc Natl AcadSci USA 2020:202010521.
https://www.pnas.org/content/117/37/22974.short
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