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分子醫(yī)學(xué)研究所發(fā)明低光毒性線粒體熒光探針，助力活細(xì)胞超分辨成像與干細(xì)胞分選

近日，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所的陳知行課題組報道了新型線粒體染料PK Mito Red 和 PK Mito Deep Red，首次在活細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了成像探針光毒性的明顯降低。通過與分子醫(yī)學(xué)所陳良怡課題組和西湖大學(xué)雷凱課題組合作，實(shí)驗(yàn)表明新染料在各種成像條件下對細(xì)胞的光毒性顯著低于MitoTracker系列商業(yè)染料，也可以用于渦蟲干細(xì)胞流式分選，具有全面的高生物相容性。該工作于7月29日以Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging 為題，在線發(fā)表在Chemical Science上。

圖1 新型探針的結(jié)構(gòu)、光譜和在HeLa細(xì)胞中的光毒性

線粒體是細(xì)胞重要的能量中心和代謝調(diào)控中心，其結(jié)構(gòu)高度動態(tài)，研究非常依賴熒光成像實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)有的商用熒光探針亮度和定位雖然經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，但光毒性仍然很強(qiáng)，不能滿足長時間熒光成像，特別是近年來快速發(fā)展的超分辨熒光成像的要求。為了最大程度抑制探針產(chǎn)生三線態(tài)進(jìn)而產(chǎn)生ROS的過程，從而減少光毒性，團(tuán)隊(duì)采用了之前應(yīng)用于染料激光、單分子成像等領(lǐng)域減少光漂白的分子內(nèi)綴合三線態(tài)淬滅劑（自修復(fù)染料 self-healing dye）的策略。通過HeLa細(xì)胞的光照存活實(shí)驗(yàn)找到了有效降低光毒性的環(huán)辛四烯（COT）基團(tuán)，而后合成了兩種以Cyanine為母核，綴合COT的熒光探針PK Mito Red （PKMR）和 PK Mito Deep Red（PKMDR）。新探針在各種成像實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出極低的光毒性。例如在對光毒性極為敏感的大鼠心肌細(xì)胞的3D四色成像實(shí)驗(yàn)中，商業(yè)染料MitoTracker Deep Red標(biāo)記的細(xì)胞在5-8幀后就會發(fā)生線粒體損傷、細(xì)胞收縮死亡，而使用新探針PK Mito Deep Red 標(biāo)記的細(xì)胞在相同條件下，可以進(jìn)行20幀以上的四色成像，光毒性降低3倍以上，可觀測到更多動態(tài)信息。

圖2 新型探針在顯微成像中展示了低光毒性（左側(cè) COS7細(xì)胞Hessian-SIM超分辨成像，右側(cè) 大鼠心肌細(xì)胞3D 共聚焦成像）

在Hessian-SIM超分辨成像體系中，新探針在展示了清晰的線粒體嵴結(jié)構(gòu)圖像的同時，最大程度的保留了線粒體的原始形態(tài)。使用商業(yè)染料MitoTracker Red CMXRos （MTR）標(biāo)記的線粒體在140幀左右就發(fā)生了腫脹和明顯形變，200幀以上已不可見嵴等正常生理結(jié)構(gòu)，而PKMR標(biāo)記的線粒體可以提供1000幀（10 fps）以上的健康線粒體圖像 ，第2000幀左右線粒體的形變程度仍小于商業(yè)探針相應(yīng)的第200幀圖像。

團(tuán)隊(duì)還測試了新探針在流式細(xì)胞分選和原代成體干細(xì)胞中的應(yīng)用。在渦蟲的干細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)中，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)PKMR標(biāo)記線粒體可以幫助分選出干細(xì)胞群，而MTR分選則效果不佳。同時，PKMR標(biāo)記的干細(xì)胞在體外仍能維持較好的活性和干性，在移植回?zé)o干細(xì)胞渦蟲后仍然能夠增殖分化。因此，新探針展示了在流式熒光分析分選中優(yōu)秀的生物相容性，能夠極大助力干細(xì)胞研究相關(guān)的生物應(yīng)用。

這項(xiàng)工作的完成離不開北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)所在線粒體和生物成像領(lǐng)域的戰(zhàn)略布局，使得探針技術(shù)，顯微鏡技術(shù)以及科學(xué)問題能夠相互啟發(fā)，緊密合作。成果凝聚了楊中天（北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)所研究助理，共同一作），李柳菊（北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)所博士研究生，共同一作）等團(tuán)隊(duì)成員的辛勤工作，也得到了國家自然科學(xué)基金，生命科學(xué)聯(lián)合中心，西湖大學(xué)，北大超算平臺，分子所質(zhì)譜平臺，和北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)南京轉(zhuǎn)化院等單位的大力支持與資助。陳知行課題組大量制備了PK Mito探針，歡迎有需要的課題組聯(lián)系合作，利用新工具探索線粒體動態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。

原文鏈接：

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/sc/d0sc02837a#!divAbstract

課題組網(wǎng)站：

陳知行：

https://www.imm.pku.edu.cn/kytd/rcdw/64639.htm

陳良怡：

https://www.imm.pku.edu.cn/kytd/rcdw/24147.htm

雷凱：

https://www.westlake.edu.cn/info/1391/2963.htm