午夜亚洲成av毛片_精品熟女少妇a∨免费久久i_午夜福利在线观看6080_99久高清在线播放

陳雷研究組揭示人源TRPC5通道被不同小分子所抑制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

TRPC5是受體激活的非選擇性陽離子通道，屬于瞬時受體電位通道（TRP）家族中的經(jīng)典型亞家族（TRPC）1。TRPC5通道的激活將引起細胞膜去極化和胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度上升。TRPC5通道主要表達于腦組織，在肝臟、腎臟等器官中也有一定程度的分布2-4。TRPC5介導(dǎo)多種生理過程，與恐懼、焦慮、抑郁等情緒的產(chǎn)生以及進行性腎臟疾病有關(guān)5,6。近期研究表明TRPC5通道是治療焦慮、抑郁和腎病的潛在藥物靶點7-9。目前，由Hydra公司和Boehringer Ingelheim合作開發(fā)的一種TRPC4/5抑制劑正在臨床試驗中，用于治療焦慮和抑郁10；由Goldfinch Bio開發(fā)的TRPC5抑制劑GFB-887（NCT number: NCT03970122）正處于治療腎病的臨床I期試驗中。盡管TRPC5抑制劑的開發(fā)如火如荼，TRPC5抑制劑是如何結(jié)合TRPC5通道并發(fā)揮抑制作用的仍不清楚。

2021年3月8日，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳雷研究組在eLife雜志上報導(dǎo)了人源TRPC5通道分別與兩種小分子抑制劑結(jié)合的高分辨結(jié)構(gòu)。

(文章鏈接:https://elifesciences.org/articles/63429 )

作者們純化了C端截短的人源TRPC5(hTRPC51-764)，該截短體具有比全長TRPC5更高的四聚體表達量，并且像全長TRPC5一樣，仍然能被激活劑(-)-englerinA(簡稱EA)和高濃度胞外鈣激活，也能被抑制劑clemizole(簡稱CMZ)和HC-070抑制。CMZ是苯并咪唑衍生物，HC-070是甲基黃嘌呤衍生物，對TRPC4、TRPC5具有很高的抑制效力。這兩類抑制劑具有截然不同的大小、形狀和化學(xué)特性，因而可能結(jié)合在TRPC5上的不同位置。作者們向純化后的hTRPC51-764蛋白樣品中分別添加CMZ和HC-070，制備了冷凍電鏡樣品，通過單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了2.7 ?高分辨率的hTRPC51-764與CMZ結(jié)合的電子密度和hTRPC51-764與HC-070結(jié)合的電子密度并搭建了原子模型。

結(jié)構(gòu)顯示抑制劑結(jié)合的TRPC5具有四重對稱性（圖1），整個通道由跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成，并且通道處于關(guān)閉狀態(tài)。

圖1 抑制劑結(jié)合狀態(tài)的人源TRPC5整體結(jié)構(gòu)

CMZ結(jié)合在跨膜區(qū)的由跨膜螺旋S1-S4組成的電壓傳感器樣結(jié)構(gòu)域(VSLD)（圖2）。與CMZ距離近的氨基酸中，F(xiàn)414與CMZ的氯苯環(huán)形成π-π堆積作用；Y374,M442,Y446和P659與CMZ形成疏水相互作用（圖2）。功能實驗結(jié)果顯示，將N443突變成TRPC3/6上對應(yīng)的氨基酸亮氨酸后，CMZ的抑制效力明顯減弱（圖2），說明N443對于CMZ發(fā)揮抑制作用很重要，也解釋了CMZ對于TRPC不同亞型的選擇作用。

圖2 CMZ在TRPC5上的結(jié)合位點

HC-070結(jié)合在跨膜區(qū)的孔道結(jié)構(gòu)域，結(jié)合位點由一個亞基的跨膜螺旋S5、孔道螺旋和相鄰亞基的跨膜螺旋S6組成 （圖3）。HC-070與TRPC5上的眾多氨基酸有相互作用：F576的側(cè)鏈與HC-070的甲基黃嘌呤形成π-π堆積作用；R557,Q573，W577與HC-070的羥丙基形成極性相互作用；F599, A602和T603同時也參與穩(wěn)定羥丙基；F569和L572與HC-070的氯苯環(huán)形成疏水相互作用（圖3）。功能實驗結(jié)果顯示，HC-070對以下這些突變體：R557A, F569A, L572A, Q573A, F599A，F599N，T603A的抑制效力減弱，其中，對Q573A的抑制效力減弱得最明顯（圖3），說明Q573A與HC-070羥丙基形成的氫鍵對于HC-070結(jié)合并抑制TRPC5具有至關(guān)重要的作用。

圖3 HC-070在TRPC5上的結(jié)合位點

在電子密度圖中，作者還觀察到了結(jié)合的離子和脂類。其中一個可能的離子結(jié)合位點位于跨膜區(qū)的VSLD，由E418，E421，N436和D439組成（圖4）。在鼠源TRPC4和鼠源TRPC5中也曾觀察到相似密度11,12；在TRPM2，TRPM4和TRPM8中觀察到的相似密度被鑒定為鈣離子13-15。作者們發(fā)現(xiàn)E418Q-E421Q-D439N三突變體失去了對胞外鈣的響應(yīng)，說明該位點對于鈣激活有著至關(guān)重要的作用。觀察到的另一個可能的離子結(jié)合位點位于胞質(zhì)區(qū)，由H172,C176,C178,C181組成，類似于細菌中葡糖激酶的HC3型鋅結(jié)合位點16。C176A-C178A-C181A三突變體對EA和鈣的響應(yīng)不變，說明該位點可能參與離子通道門控以外的其他調(diào)控作用。

在跨膜區(qū)有數(shù)個脂類/去垢劑結(jié)合位點 （圖4）。在結(jié)合CMZ的TRPC5電子密度圖中，在跨膜螺旋S5和S6之間觀察到了類似DAG的密度。HPLC-MS實驗也證明蛋白樣品中含有DAG。在結(jié)合HC-070的TRPC5電子密度圖中，DAG頭部的密度被HC-070替代了，而兩條脂肪鏈尾巴的密度卻還保留著。

-

圖4 離子和脂類在TRPC5上的結(jié)合位點

綜上所述，本項研究解析了人源TRPC5與兩類不同的抑制劑結(jié)合的高分辨結(jié)構(gòu)，揭示了這兩類抑制劑在TRPC5上的結(jié)合位點，并發(fā)現(xiàn)抑制劑通過將TRPC5穩(wěn)定在無配體結(jié)合的關(guān)閉狀態(tài)從而發(fā)揮其抑制功能。此項研究為深入理解TRPC5的門控機制和基于結(jié)構(gòu)的藥物優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

本項研究的第一作者為北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)所博士研究生宋康成和韋淼；北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所代謝研究檢測平臺主管權(quán)力博士完成了DAG的鑒定實驗；博士生郭文君、康云路和博士后吳驚香參與了部分實驗；陳雷研究員為通訊作者。本工作獲得科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金委、生命科學(xué)聯(lián)合中心等經(jīng)費支持。該工作的冷凍電鏡樣品制備、篩選和采集在北京大學(xué)電鏡室和冷凍電鏡平臺上完成，得到了李雪梅、郭振璽、邵博、裴霞和王國鵬等人的幫助。

?

1?Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature 426, 517-524, doi:10.1038/nature02196 (2003).

2?Philipp, S. et al. A novel capacitative calcium entry channel expressed in excitable cells. The EMBO journal 17, 4274-4282, doi:10.1093/emboj/17.15.4274 (1998).

3?Sossey-Alaoui, K. et al. Molecular Cloning and Characterization of TRPC5 (HTRP5), the Human Homologue of a Mouse Brain Receptor-Activated Capacitative Ca2+ Entry Channel. Genomics 60, 330-340, doi:https://doi.org/10.1006/geno.1999.5924 (1999).

4?Uhlén, M. et al. Tissue-based map of the human proteome. Science (New York, N.Y.) 347, 1260419, doi:10.1126/science.1260419 (2015).

5?Riccio, A. et al. Essential role for TRPC5 in amygdala function and fear-related behavior. Cell 137, 761-772, doi:10.1016/j.cell.2009.03.039 (2009).

6?Schaldecker, T. et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. The Journal of clinical investigation 123, 5298-5309, doi:10.1172/jci71165 (2013).

7?Just, S. et al. Treatment with HC-070, a potent inhibitor of TRPC4 and TRPC5, leads to anxiolytic and antidepressant effects in mice. PloS one 13, e0191225, doi:10.1371/journal.pone.0191225 (2018).

8?Yang, L. P. et al. Acute Treatment with a Novel TRPC4/C5 Channel Inhibitor Produces Antidepressant and Anxiolytic-Like Effects in Mice. PloS one 10, e0136255, doi:10.1371/journal.pone.0136255 (2015).

9?Zhou, Y. et al. A small-molecule inhibitor of TRPC5 ion channels suppresses progressive kidney disease in animal models. Science (New York, N.Y.) 358, 1332-1336, doi:10.1126/science.aal4178 (2017).

10?Wulff, H., Christophersen, P., Colussi, P., Chandy, K. G. & Yarov-Yarovoy, V. Antibodies and venom peptides: new modalities for ion channels. Nature Reviews Drug Discovery 18, 339-357, doi:10.1038/s41573-019-0013-8 (2019).

11?Duan, J. et al. Structure of the mouse TRPC4 ion channel. Nature communications 9, 3102, doi:10.1038/s41467-018-05247-9 (2018).

12?Duan, J. et al. Cryo-EM structure of TRPC5 at 2.8-A resolution reveals unique and conserved structural elements essential for channel function. Science advances 5, eaaw7935, doi:10.1126/sciadv.aaw7935 (2019).

13?Autzen, H. E. et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science (New York, N.Y.) 359, 228-232, doi:10.1126/science.aar4510 (2018).

14?Huang, Y., Winkler, P. A., Sun, W., Lü, W. & Du, J. Architecture of the TRPM2 channel and its activation mechanism by ADP-ribose and calcium. Nature 562, 145-149, doi:10.1038/s41586-018-0558-4 (2018).

15?Yin, Y. et al. Structural basis of cooling agent and lipid sensing by the cold-activated TRPM8 channel. Science (New York, N.Y.) 363 (2019).

16?Miyazono, K.-i. et al. Substrate Recognition Mechanism and Substrate-Dependent Conformational Changes of an ROK Family Glucokinase from <span class="named-content genus-species" id="named-content-1">Streptomyces griseus</span&gt. Journal of Bacteriology 194, 607, doi:10.1128/JB.06173-11 (2012).

?

?

返回