清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭永實(shí)驗(yàn)室合作在《Talanta》報(bào)道高靈敏和防污染的“準(zhǔn)共聚焦”微液滴數(shù)字PCR閱讀儀
2019年8月1日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系郭永實(shí)驗(yàn)室合作在《Talanta》在線發(fā)表題為《一種用于高精準(zhǔn)和防污染檢測(cè)的“準(zhǔn)共聚焦”熒光流式微液滴閱讀儀》（A "Quasi" Confocal Droplet Reader Based On Laser-Induced Fluorescence (LIF) Cytometry for Highly-Sensitive and Contamination-Free Detection）的研究論文，該研究創(chuàng)新地采用了“準(zhǔn)共聚焦”式檢測(cè)光路和全封閉的微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了微液滴數(shù)字PCR的高精準(zhǔn)和防污染檢測(cè)。
微液滴數(shù)字PCR是一種單分子水平的核酸定量分析技術(shù)。其策略是：首先將PCR反應(yīng)體系分割為大量的微液滴，使得絕大多數(shù)微液滴內(nèi)僅含有0個(gè)或1個(gè)模板分子（分別稱為“陰性微液滴”和“陽(yáng)性微液滴”）；然后經(jīng)過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，“陽(yáng)性微液滴”呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而“陰性微液滴”呈現(xiàn)出較弱的背景熒光信號(hào)；最后，通過微液滴內(nèi)熒光的檢測(cè)和分類，可以得到待測(cè)模板的拷貝數(shù)。
數(shù)字PCR的微液滴直徑介于10-100 μm之間，這對(duì)傳統(tǒng)熒光檢測(cè)技術(shù)提出很高的要求。如果“陽(yáng)性微液滴”與“陰性微液滴”之間的熒光信號(hào)對(duì)比度偏低，將引發(fā)“陽(yáng)性微液滴”與“陰性微液滴”區(qū)分的困難和錯(cuò)誤。與此同時(shí)，由于微液滴數(shù)字PCR具有超高的靈敏性，在PCR反應(yīng)后的任何開放式操作都可能造成微液滴內(nèi)容物的揮發(fā)和逸出，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染。目前商業(yè)化微液滴數(shù)字PCR儀器多涉及PCR反應(yīng)后的開放式操作，比如微液滴的吸取和轉(zhuǎn)移等，這在臨床應(yīng)用中可能導(dǎo)致樣本假陽(yáng)性的嚴(yán)重后果。
為了解決上述不足，在這項(xiàng)研究中，研究人員采用了“準(zhǔn)共聚焦”式熒光流式來構(gòu)建微液滴閱讀儀的光路（圖1），其激發(fā)光路采用了新型的離焦激發(fā)模式，使得激發(fā)光斑恰好與微液滴的尺寸相匹配，最大限度地激發(fā)整個(gè)微液滴內(nèi)的熒光信號(hào)，提高“陽(yáng)性微液滴”與“陰性微液滴”之間的信號(hào)對(duì)比度；其熒光檢測(cè)光路使用與微流道共軛的小孔來消除微流道以外的雜散光，提高熒光信號(hào)的信噪比。基于上述光路，研究人員實(shí)現(xiàn)了10-10,000模板拷貝的微液滴數(shù)字PCR高靈敏度檢測(cè)，其相對(duì)誤差小于5%，線性度r²＞0.998。
圖1：微液滴閱讀儀采用的“準(zhǔn)共聚焦”熒光流式光路
與此同時(shí)，研究人員設(shè)計(jì)了新型的微流控芯片（圖2），該芯片采用了一種“密封-穿刺”的結(jié)構(gòu)，使用適配器（Adaptor）在管蓋（Rubber cap）外側(cè)形成更大范圍的密封，使得反應(yīng)管蓋被刺穿時(shí)微液滴處于一個(gè)更大的密閉空間中，從而在檢測(cè)過程中保持了嚴(yán)格的密閉，避免微液滴核酸擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠的污染?；谏鲜鲂酒Y(jié)構(gòu)，研究人員在連續(xù)進(jìn)行了7天表皮生長(zhǎng)因子受體基因（EGFR）T790M突變位點(diǎn)的檢測(cè)后，將6管未加任何模板的EGFR T790M反應(yīng)體系暴露于微液滴閱讀儀周邊15分鐘，以充分地吸收可能從微液滴閱讀儀中逸出的氣溶膠污染。微液滴數(shù)字PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示，所有6管未加模板的EGFR T790M反應(yīng)體系全部呈陰性結(jié)果，證明該微液滴閱讀儀可有效避免微液滴數(shù)字PCR的污染。
圖2：微液滴閱讀儀采用的微流控芯片
該研究為微液滴數(shù)字PCR的臨床應(yīng)用提供了一種高靈敏和防污染的自動(dòng)化檢測(cè)裝置。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，開發(fā)高靈敏和防污染的單分子核酸檢驗(yàn)和定量分析技術(shù)對(duì)于疾病的篩查、診斷、用藥指導(dǎo)、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后均具有重要意義。
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院的朱修銳博士和劉寶霞博士為該論文的共同第一作者，醫(yī)學(xué)院郭永研究員和精儀系荊高山博士對(duì)該研究進(jìn)行了指導(dǎo)，北京新羿生物科技有限公司參與了合作研究。本課題得到國(guó)家自然科學(xué)基金和北京新羿生物科技有限公司橫向合作課題等經(jīng)費(fèi)資助。
◎論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.120200
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