清華大學醫(yī)學院李海濤課題組發(fā)文首次揭示”局部開鏈”與哺乳動物ALKBH1催化基因組6mA去甲基化的關系
2020年2月12日，清華大學醫(yī)學院李海濤研究組在Cell Research期刊以長文形式報道了題為“哺乳動物ALKBH1是一類非配對DNA的N6-甲基腺嘌呤去甲基化酶” （Mammalian ALKBH1 serves as an N6-mA demethylase of unpairing DNA）的研究論文。該研究通過建立穩(wěn)定可靠的體外酶活檢測體系，首次鑒定出ALKBH1為一類局部非配對DNA的N6-甲基腺嘌呤（6mA）去甲基化酶（圖1）；首次解析了ALKBH1自由態(tài)以及與DNA底物的復合物結構，揭示了ALKBH1偏好局部非配對核酸底物的結構基礎，為哺乳動物基因組第九堿基6mA的調控生物學提供了全新的研究視角。
圖1 ALKBH1偏好局部開鏈DNA并催化6mA的去甲基化
6mA是哺乳動物基因組中除5甲基胞嘧啶及其衍生物（5mC，5hmC，5fC，5caC）之外的又一類表觀修飾，被稱為哺乳動物基因組第九堿基?；蚪M6mA的水平在早期胚胎發(fā)育和癌癥發(fā)生等過程中呈現出劇烈波動，其背后的調控機制是解碼這一新型修飾堿基生物學功能的關鍵。本研究合作者耶魯大學Andrew Xiao教授實驗室曾在2016年在Nature發(fā)文首次報道ALKBH1具有DNA 6mA的去甲基化酶活力。但自1996年ALKBH1被克隆以來，其生理底物一直存在巨大爭議，相關結構亦未解析，亟待進一步研究。
ALKBH1是Fe(II)-α-酮戊二酸雙加氧酶超家族中AlkB家族的成員，與5mC去甲基化酶Tet家族存在很近的親緣關系。在本研究中，研究者首先建立了基于液相-質譜（LC-MS/MS）的定量酶活檢測體系，系統(tǒng)地檢測了ALKBH1對各類核酸底物的去甲基化酶活，發(fā)現ALKBH1偏好催化局部開鏈的鼓泡DNA而非單鏈DNA中6mA的去甲基化，且完全無法催化雙鏈底物的去甲基化（圖2）；進一步實驗表明，ALKBH1可以同樣高效催化多種局部非配對核酸（如bulge、R-loop、D-loop和stem loop等）中6mA的去甲基化，而對堿基序列沒有特別偏好，首次闡明了ALKBH1對底物二級結構的高度依賴性。同時，研究者建立的基于寡鏈核酸的質譜測活方法，成功捕獲了6mA去甲基化過程的中間產物N6-羥甲基腺嘌呤（6hmA），為ALKBH1催化的化學機理提供了新證據。6hmA在非酶促條件下，可以穩(wěn)定存在數小時，提示6hmA有可能作為一種亞穩(wěn)態(tài)表觀修飾參與調控。
圖2 ALKBH1識別與催化非配對DNA 6mA去甲基化的生化結構基礎
其它AlkB家族成員以及Tet家族成員均未表現出對局部非配對核酸的偏好，那么ALKBH1這種獨特底物偏好的結構基礎是什么呢？如圖2所示，ALKBH1由位于C端的催化結構域（DSBH）、相鄰的底物識別亞結構域（NRL）以及N端的延長區(qū)域（NTE）構成，其中NRL亞結構域又細分為Flip1和Flip2兩部分。研究者首先解析了2.5 Å的ALKBH1自由態(tài)結構，發(fā)現其Flip1遠離酶活中心且外翻伸展，這與其它AlkB家族成員以及Tet2“回扣式”的Flip1構象形成了鮮明反差。已有研究表明，“回扣式”Flip1構象對于穩(wěn)定雙鏈DNA修飾堿基外翻，促使其伸向活性中心完成催化有著重要作用。ALKBH1中Flip1的伸展構象導致其失去了自主外翻DNA堿基的能力，因此ALKBH1無法催化雙鏈DNA底物，而其酶活發(fā)揮需要堿基的預先翻轉。
隨后，研究者通過定點交聯策略，使原本結合較弱的ALKBH1和凸起DNA底物形成穩(wěn)定、均一的復合物，并最終在2.4 Å分辨率水平解析了復合物晶體結構（圖2）。結果表明， ALKBH1伸展的Flip1與其N端的α1位于催化中心兩側，分別與翻轉堿基左右兩側的雙鏈區(qū)域互作。其中，α1和Flip1上的R24和R159殘基分別以“精氨酸手指”方式插入雙鏈區(qū)域的小溝中，協(xié)助將DNA凸起中外翻的修飾堿基呈遞至催化中心實現去甲基化。復合物結構解析突顯了局部非配對底物雙鏈區(qū)在ALKBH1底物識別過程中的關鍵作用，闡明了ALKBH1偏好催化局部開鏈核酸底物而非單鏈底物的原因。研究者進一步對小鼠早期胚胎發(fā)育細胞進行DIP-seq以及ssDNA-seq分析，發(fā)現N6-mA與基因組的非配對區(qū)域存在著顯著的共定位，暗示著N6-mA的調控可能與真核生物染色體高級結構的動態(tài)變化密切相關，這將為后續(xù)ALKBH1以及N6-mA的功能研究提供全新的視角。
清華大學李海濤教授和耶魯大學Andrew Xiao教授為共同通訊作者。李海濤實驗室張敏博士（清華-北京生命科學聯合中心2015級博士研究生）、醫(yī)學院博士研究生楊舒敏以及耶魯大學博士研究生Raman Nelakanti為本文共同第一作者。第二作者2018級PTN聯合項目博士生趙文濤同學和清華大學代謝質譜平臺的劉曉蕙老師為本工作的順利開展作出了重要貢獻。
本工作得到國家自然科學基金委員會、科技部重點研發(fā)計劃、清華-北京生命科學聯合中心、北京市結構生物學高精尖創(chuàng)新中心、北京生物結構前沿研究中心等機構的經費支持。本課題得到上海同步輻射光源、清華大學X-ray晶體學平臺以及代謝質譜平臺的大力支持與協(xié)助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41422-019-0237-5
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