陳春來課題組在《Cell Reports》發(fā)表論文報(bào)道CRISPR/Cas9蛋白切割DNA過程中的調(diào)控和校驗(yàn)機(jī)制
2018年1月9日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來研究組在《Cell Reports》雜志發(fā)表了研究論文，題目為“The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET”（利用單分子FRET揭示Cas9在DNA切割過程中的動(dòng)態(tài)構(gòu)象）。該論文展示了Cas9可以自發(fā)地在三種主要構(gòu)象中轉(zhuǎn)換，揭示了Cas9蛋白與PAM遠(yuǎn)端DNA/RNA雙鏈相互作用可長程別構(gòu)調(diào)控Cas9切割結(jié)構(gòu)域的局部構(gòu)象，這是Cas9切割靶標(biāo)DNA之前的最后校驗(yàn)步驟。最后，該文提出了優(yōu)化和設(shè)計(jì)高保真Cas9的新思路，即通過突變Cas9蛋白以影響這種長程別構(gòu)調(diào)控機(jī)制，可提高Cas9的識(shí)別特異性。
CIRSPR/Cas9是一種可以由一條單鏈sgRNA（single guide RNA）指導(dǎo)的利用Cas9核酸酶對(duì)靶向DNA進(jìn)行特異性識(shí)別和切割的技術(shù)。由于其可以高效快捷地靶向切割DNA而被廣泛地應(yīng)用于基因編輯、基因表達(dá)調(diào)控、基因定位和成像等領(lǐng)域。但是，Cas9的脫靶效應(yīng)嚴(yán)重阻礙了其應(yīng)用。盡管有一些研究報(bào)道了通過改造Cas9和截短sgRNA來提高其特異性，但仍然缺乏對(duì)Cas9切割靶標(biāo)DNA的詳細(xì)分子機(jī)制的全面認(rèn)知，因而難以對(duì)CIRSPR/Cas9的優(yōu)化提供系統(tǒng)性的指導(dǎo)。
單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）是檢測(cè)生物大分子構(gòu)象變化的有利工具。該研究通過在Cas9蛋白的特異位點(diǎn)上標(biāo)記熒光團(tuán)，基于全內(nèi)反射熒光顯微鏡快速靈敏地捕捉單個(gè)Cas9分子的FRET效率變化以及在每個(gè)FRET狀態(tài)的停留時(shí)間，以此反應(yīng)Cas9的構(gòu)象變化，并提供該過程中的一系列動(dòng)力學(xué)參數(shù)。該研究發(fā)現(xiàn)，Cas9展現(xiàn)出三種構(gòu)象狀態(tài)，并可以自發(fā)的在這三種狀態(tài)中自由切換。靶標(biāo)序列的PAM遠(yuǎn)端與sgRNA的大于三個(gè)堿基的錯(cuò)配，導(dǎo)致Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域（核酸切割結(jié)構(gòu)域）稍偏離了其正確切割位點(diǎn)，因而將其從切割活性態(tài)轉(zhuǎn)化為非活性狀態(tài)。而這種對(duì)錯(cuò)配的校驗(yàn)機(jī)制是Cas9蛋白與PAM遠(yuǎn)端DNA/RNA雙鏈相互作用對(duì)其HNH結(jié)構(gòu)域的長程別構(gòu)調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。
圖1. Cas9蛋白切割靶標(biāo)DNA的動(dòng)態(tài)動(dòng)態(tài)構(gòu)象和校驗(yàn)機(jī)制模型
通過對(duì)Cas9一些高保真突變體的研究，該文章證明了在Cas9/RNA/DNA三聚復(fù)合物中引入額外的能量損耗導(dǎo)致Cas9切割底物的能壘升高，從而提高了Cas9切割特異性。該文章為優(yōu)化Cas9特異性提供了新思路，即通過減弱Cas9與PAM遠(yuǎn)端DNA/RNA異源雙鏈的相互作用來提高切割能壘，從而達(dá)到提高特異性的目的。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來研究員為本文通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院CLS項(xiàng)目三年級(jí)博士生楊夢(mèng)銥，清華大學(xué)生命學(xué)院三年級(jí)直博生彭思佳為共同第一作者。本工作獲得了北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心及國家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費(fèi)支持。
原文鏈接
http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(17)31872-7
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com