顏寧研究組報道首個人源電壓門控鈉離子通道結(jié)構(gòu)
當(dāng)?shù)貢r間2018年9月6日，顏寧研究組在《科學(xué)》（Science）在線發(fā)表了題為《人源電壓門控鈉離子通道Nav1.4與β1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)》（Structure of the human voltage-gated sodium channel Nav1.4 in complex with β1）的研究長文，揭示了首個人源電壓門控鈉離子通道（下簡稱鈉通道）Nav1.4與它的特異性調(diào)節(jié)亞基β1復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，分辨率高達(dá)3.2 埃（即0.32納米），為深入理解其作用機制及疾病相關(guān)突變的機理提供了可靠模板。
1945年，英國科學(xué)家霍奇金（Hodgkin）和赫胥黎（Huxley）第一次在槍烏賊的巨大神經(jīng)元上檢測電流并首次記錄到靜息電位和動作電位；1952年，他們發(fā)現(xiàn)了電壓門控的鈉電流，開啟了現(xiàn)代生物體內(nèi)電信號研究的新紀(jì)元。鈉通道負(fù)責(zé)動作電位的發(fā)生和傳播，是所有神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞上電信號的基礎(chǔ)。霍奇金和赫胥黎的發(fā)現(xiàn)為他們贏得了1963年的諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。70年代，內(nèi)爾（Neher）和索克曼（Sakmann）開始用膜片鉗技術(shù)記錄單個離子通道的電流，內(nèi)爾于1980年首次記錄到單個鈉通道的電流。他們因此獲得了1991年的諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。1984年，日本科學(xué)家沼田秀作（Shosaku Numa）等人第一次克隆出電鰻中的鈉通道的基因。幾十年來，包括海利（Hille）、阿姆斯特朗（Armstrong）、波澤尼拉（Bezanilla）、卡特羅（Catteral）等在內(nèi)的著名科學(xué)家極大推動了鈉通道的生物物理和電生理研究。
鈉通道是由負(fù)責(zé)感受電壓和離子選擇的α亞基以及1-2個調(diào)節(jié)它的β亞基組成的。在人體中，α亞基有9種不同的亞型，分別被命名為Nav1.1-1.9，β亞基有4種亞型，分別被命名為β1-β4。α亞基一般包含大約2000個氨基酸，其中包含了四個序列相近結(jié)構(gòu)類似的跨膜結(jié)構(gòu)域I-IV，每個結(jié)構(gòu)域含有6根跨膜螺旋。每個結(jié)構(gòu)域中的前四根跨膜螺旋S1-S4構(gòu)成電壓感受器(VSD)，而四組S5-S6跨膜螺旋共同構(gòu)成位于整個結(jié)構(gòu)中央的負(fù)責(zé)離子通透的孔道結(jié)構(gòu)域，連接跨膜螺旋S5-S6之間的兩個半穿膜短螺旋共同支撐一小段伸展序列，構(gòu)成負(fù)責(zé)實現(xiàn)離子通透特異性的選擇篩。連接第三和第四個結(jié)構(gòu)域之間的序列比較短，已被證明對于鈉通道的快速失活至關(guān)重要，但具體機理并不清楚。快速失活機制可以讓鈉通道在感受刺激，引起動作電位后迅速關(guān)閉，防止神經(jīng)肌肉細(xì)胞持續(xù)性放電。同時鈉鉀泵重建膜電勢，為下一次動作電位做好準(zhǔn)備。因此鈉通道的快速失活對它發(fā)揮正常的生理功能至關(guān)重要。
鈉通道的9種亞型具有組織分布特異性，它們的異常失活或者激活與多種嚴(yán)重的神經(jīng)、心血管、和肌肉系統(tǒng)的疾病相關(guān)，例如Nav1.1和Nav1.5各自有400多種點突變分別與癲癇和心律失常相關(guān)，Nav1.4的異常會導(dǎo)致肌肉僵直或高鉀血型周期性癱瘓，Nav1.7或Nav1.8的異常會造成痛覺喪失或者疼痛異常等。因此，鈉通道是重要的制藥靶點，是許多國際著名制藥公司的重點研究對象。此外，鈉通道是包括蛇毒、蝎毒、河豚毒素、蜘蛛毒素等在內(nèi)的多種動物毒素的直接作用靶點。經(jīng)過70多年的研究，關(guān)于人源鈉通道的工作機理的電生理學(xué)研究已經(jīng)鋪天蓋地，但因為獲取哪怕微量的優(yōu)質(zhì)樣品都極端困難，所以人源鈉通道是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最富挑戰(zhàn)性的蛋白之一。
顏寧自2007年獨立領(lǐng)導(dǎo)實驗室以來，就致力于鈉通道的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，于2012年報道了一類海洋菌中的鈉通道NavRh的晶體結(jié)構(gòu) (1)。但是細(xì)菌與真核生物的鈉通道具有最基本的若干區(qū)別，比如具有不同的離子選擇性，缺少快速失活機制，無法被毒素識別等等，因此不能成為研究真核鈉通道的替代蛋白。所以，顏寧過去五年一直集中力量攻堅真核鈉通道的結(jié)構(gòu)與機理，終于在2017年首次報道了第一個真核鈉通道的原子模型，是來自美國蟑螂中命名為NavPaS的3.8埃分辨率電鏡結(jié)構(gòu) (2)，幾個月后又報道了在鈉通道研究史中占據(jù)重要地位的來自電鰻的鈉通道EeNav1.4的電鏡結(jié)構(gòu) (3)，并在該結(jié)構(gòu)中首次看到鈉通道的α亞基與β亞基之間的相互作用。盡管這兩個結(jié)構(gòu)代表了鈉通道結(jié)構(gòu)與機理研究的巨大飛躍，但是這兩個通道都無法在外源表達(dá)系統(tǒng)中進行功能研究，從而限制它們成為模式研究蛋白。
歷經(jīng)數(shù)年，顏寧教授課題組終于一步步克服了蛋白表達(dá)純化和冷凍樣品制備等多個技術(shù)瓶頸，解析了人源骨骼肌鈉通道亞型Nav1.4的高達(dá)3.2埃的電鏡結(jié)構(gòu)，首次揭示了完整的電壓感受結(jié)構(gòu)域、離子選擇篩、快速失活原件等關(guān)鍵功能單元的結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，他們將在肌肉強直以及高鉀血型周期性癱瘓病人中發(fā)現(xiàn)的50多個單點突變一一對應(yīng)到結(jié)構(gòu)上，并且重點討論了與電壓感知和快速失活相關(guān)的突變，從而為理解致病機理提供了重要分子依據(jù)。
圖1. 人源Nav通道Nav1.4-β1的三維結(jié)構(gòu)
（A）人源Nav通道Nav1.4-β1的跨膜區(qū)和胞外區(qū)結(jié)構(gòu)得到很好的解析；（B）從胞外側(cè)看Nav1.4-β1有大面積的負(fù)電區(qū)域；（C）Nav1.4-β1的中央孔道從胞內(nèi)側(cè)看是開放狀態(tài)；（D）計算Nav1.4-β1的中央孔道的半徑。
回首過去十多年，顏寧在清華大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的研究組陸續(xù)解析了原核電壓門控鈉離子通道NavRh的結(jié)構(gòu) (1)，首個高分辨率的電壓門控鈣離子通道復(fù)合物Cav1.1的結(jié)構(gòu) (4, 5)，首個真核鈉通道NavPaS的結(jié)構(gòu) (2)，首個鈉通道與調(diào)控亞基的復(fù)合物結(jié)構(gòu) (3)，首個動物毒素與鈉通道復(fù)合物的結(jié)構(gòu) (6)，終于獲得首個人源鈉通道的結(jié)構(gòu)。因為Nav1.4具有確定的生理功能，在此之前已經(jīng)通過生物物理、電生理等各種手段在多個表達(dá)系統(tǒng)中廣泛研究，如今其精確結(jié)構(gòu)的解析翻開了鈉通道結(jié)構(gòu)與機理研究新的一頁，向完整闡釋鈉通道的工作過程邁出最重要的一步。
原清華大學(xué)生命學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心顏寧教授是該篇研究論文的通訊作者。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士后、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者潘孝敬、CLS三年級博士生李張強、醫(yī)學(xué)院副研究員周強、醫(yī)學(xué)院博士后、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者申懷宗和藥學(xué)院肖百龍實驗室博士生吳坤為共同第一作者。國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）清華大學(xué)冷凍電鏡平臺和清華大學(xué)高性能計算平臺分別為該研究的數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)處理提供了支持，清華大學(xué)冷凍電鏡平臺的雷建林博士對數(shù)據(jù)收集進行了指導(dǎo)，并獲得工作人員李曉敏的技術(shù)輔助。清華大學(xué)熊巍實驗室和龔海鵬實驗室對于電生理和分子動態(tài)模擬提供了指導(dǎo)和幫助。北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心（清華）、生命科學(xué)聯(lián)合中心（清華大學(xué)）、生物膜與膜生物工程國家重點實驗室、科技部和基金委為該研究提供了經(jīng)費支持。顏寧教授自2017年秋季入職普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系后受到Shirley M. Tilghman講席教授專項啟動經(jīng)費的支持。
原文鏈接：
http://science.sciencemag.org/content/early/2018/09/05/science.aau2486
相關(guān)論文鏈接：
1. X. Zhang et al., Crystal structure of an orthologue of the NaChBac voltage-gated sodium channel. Nature 486, 130 (2012).
2. H. Shen et al., Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near-atomic resolution. Science 355, (2017).
3. Z. Yan et al., Structure of the Nav1.4-beta1 Complex from Electric Eel. Cell 170, 470 (2017).
4. J. Wu et al., Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 complex. Science (New York, N.Y 350, aad2395 (2015).
5. J. Wu et al., Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 at 3.6 A resolution. Nature 537, 191 (2016).
6. H. Shen et al., Structural basis for the modulation of voltage-gated sodium channels by animal toxins. Science (New York, N.Y, (2018).
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