施一公研究組在《自然》《科學(xué)》分別報(bào)道人體γ-分泌酶與重要底物Notch和APP復(fù)合物的高分辨率三維結(jié)構(gòu)
2018年12月31日和2019年1月10日，施一公教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)花開(kāi)兩朵，分別于《自然》（Nature）和《科學(xué)》（Science）報(bào)道了《人源γ-分泌酶識(shí)別底物Notch的結(jié)構(gòu)機(jī)制》（Structural basis of Notch recognition by human γ-secretase）以及《人源γ-分泌酶底物淀粉樣前體蛋白的識(shí)別》（Recognition of amyloid precursor protein by human γ-secretase）的文章，分別報(bào)道了分辨率為2.7埃的人體γ-分泌酶結(jié)合底物Notch以及分辨率為2.6埃的γ-分泌酶結(jié)合淀粉樣前體蛋白（APP）的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。文章報(bào)道了結(jié)合兩種不同底物后γ-分泌酶發(fā)生的構(gòu)象變化，并對(duì)這些構(gòu)象變化的功能進(jìn)行了生化研究。上述兩篇報(bào)道為理解γ-分泌酶特異性識(shí)別并切割底物的分子機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)，并為研究與癌癥以及阿爾茲海默癥相關(guān)的藥物提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。
阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease, AD）是當(dāng)今世界面臨的最為嚴(yán)峻的神經(jīng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)為腦組織切片中出現(xiàn)淀粉樣斑塊，神經(jīng)元死亡，認(rèn)知和記憶能力受損，最后腦功能?chē)?yán)重受損直至死亡。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在65歲以上人群中，其發(fā)病率高達(dá)10%，在85歲以上人群中，發(fā)病率更是達(dá)到30-50%；我國(guó)目前患該病的人口高達(dá)500萬(wàn)，約占世界患者總數(shù)的四分之一，并且由于世界范圍內(nèi)預(yù)防治療手段不足，缺乏特效藥物，該疾病有發(fā)病年齡提前，發(fā)病人數(shù)增加的趨勢(shì)，給病人及家屬造成極大痛苦，也同時(shí)為社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。
阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)理尚不明確。病人腦組織中的淀粉樣斑塊由淀粉樣蛋白前體蛋白（APP, amyloid precursor protein）被酶切割產(chǎn)生的短肽聚集而來(lái)。在此切割過(guò)程中，最關(guān)鍵的蛋白酶是γ-分泌酶（γ-secretase）。γ-分泌酶由四個(gè)跨膜蛋白亞基組成，分別為Presenilin（PS1）、Pen-2、Aph-1和Nicastrin。其中，編碼PS1蛋白的基因中有200多個(gè)突變與AD病人相關(guān)，而PS1正是行使酶切功能的關(guān)鍵活性亞基。這些突變有可能導(dǎo)致PS1功能異常而引起阿爾茲海默癥的發(fā)生。γ-分泌酶在阿爾茲海默癥的發(fā)病中扮演著重要角色，很多藥物的研發(fā)直接以γ-分泌酶作為靶點(diǎn)，希望通過(guò)調(diào)節(jié)其活性來(lái)治療疾病。此外，除淀粉樣蛋白外，重要的信號(hào)蛋白Notch也是γ-分泌酶的底物。Notch的異常切割會(huì)導(dǎo)致發(fā)育的異常，與一些諸如T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病在內(nèi)的癌癥發(fā)病也有重要聯(lián)系。作為與阿爾茲海默癥和癌癥均緊密相關(guān)的蛋白，γ-分泌酶結(jié)構(gòu)的解析與功能的研究一直是重要的科學(xué)問(wèn)題。
施一公教授2006年在清華大學(xué)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室之初，就將揭示阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)理作為重點(diǎn)研究方向，其中一個(gè)主要環(huán)節(jié)是解析γ-分泌酶的高分辨率結(jié)構(gòu)，揭示Presenilin突變體的致病機(jī)理。他們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期不懈的努力，積累了大量經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，先后于近幾年取得一系列重要突破（相關(guān)論文請(qǐng)見(jiàn)文末）。此次兩篇文章報(bào)道的研究成果是此前施一公研究組對(duì)γ-分泌酶結(jié)構(gòu)與功能系統(tǒng)研究不斷深入的延續(xù)。如前文所述，盡管施一公研究組已經(jīng)解析了γ-分泌酶的高分辨率結(jié)構(gòu)，但其如何與底物結(jié)合尚不清楚。近年來(lái)，多種旨在減少淀粉樣沉淀的γ-分泌酶活性抑制劑的臨床實(shí)驗(yàn)均宣告失敗，較為著名的是禮來(lái)公司臨床實(shí)驗(yàn)的Semagacestat。這一抑制劑雖然能夠減少淀粉樣沉淀，但并不能改善患者的認(rèn)知狀況，更嚴(yán)重的是由于同時(shí)抑制了γ-分泌酶對(duì)Notch的切割，使得患者罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)大幅增加，最終該臨床實(shí)驗(yàn)提前終止。究其原因，對(duì)γ-分泌酶結(jié)合底物機(jī)制研究的缺失是造成這一失敗的原因之一。基于此，獲得γ-分泌酶與底物Notch以及APP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，對(duì)研究γ-分泌酶的底物識(shí)別酶切機(jī)理，和以γ-分泌酶為靶標(biāo)的特異性藥物設(shè)計(jì)具有極大科學(xué)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。
由于酶與底物的結(jié)合-酶切-解離的過(guò)程是高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，獲得酶與底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)難度非常大，而γ-分泌酶與其底物都是跨膜蛋白，獲得它們的穩(wěn)定復(fù)合物是世界級(jí)難題。施一公課題組通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)和篩選，通過(guò)半胱氨酸交聯(lián)的辦法，首先成功獲得了γ-分泌酶與底物Notch的穩(wěn)定復(fù)合物。通過(guò)收集冷凍電鏡的數(shù)據(jù)，他們解析了γ-分泌酶與底物Notch的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分辨率高達(dá)2.7？，是第一個(gè)γ-分泌酶與底物復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，也是第一個(gè)膜內(nèi)蛋白水解酶與底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。之后他們基于不同底物蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)比對(duì)，利用相似的策略，順利獲得了γ-分泌酶與另一個(gè)重要底物底物APP的穩(wěn)定復(fù)合物，并獲得了其冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。
γ-分泌酶與底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中，催化亞基PS1發(fā)生了較大的構(gòu)象變化。尤為值得一提的是，在跨膜區(qū)靠近細(xì)胞內(nèi)的一側(cè)，PS1通過(guò)構(gòu)象變化，與底物的胞內(nèi)段形成穩(wěn)定的β-sheet結(jié)構(gòu)，為穩(wěn)定底物提供了保證。在此狀態(tài)下，底物的跨膜螺旋發(fā)生解旋，暴露出被酶切的位點(diǎn)。這一結(jié)構(gòu)觀察第一次直觀證明了長(zhǎng)久以來(lái)膜內(nèi)蛋白水解酶酶切底物時(shí)，底物蛋白需要發(fā)生解旋的猜想。隨后科研人員通過(guò)生物化學(xué)的手段，驗(yàn)證了觀察到的構(gòu)象變化在酶切底物中的作用。根據(jù)得到的結(jié)構(gòu)，研究組提出了γ-分泌酶結(jié)合底物并依次進(jìn)行多步酶切的機(jī)理：底物的跨膜螺旋隨著切割的進(jìn)行逐步解旋，并與γ-分泌酶形成新的中間態(tài)復(fù)合物再次進(jìn)行切割。此外，文章還討論了底物進(jìn)入γ-分泌酶活性中心的路徑。在后續(xù)解析的γ-分泌酶與底物APP穿膜區(qū)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，研究者同樣發(fā)現(xiàn)了前文中描述的特征結(jié)構(gòu)：β-sheet和底物在酶切處的解旋。對(duì)于潛在的藥物研發(fā)來(lái)說(shuō)，研發(fā)可以特異地抑制APP的切割而不影響Notch切割的藥物，對(duì)于治療阿爾茲海默癥且不導(dǎo)致癌癥等副作用具有重大價(jià)值。對(duì)于某些類(lèi)的癌癥的藥物研發(fā)亦是如此。研究組通過(guò)系統(tǒng)性地在結(jié)構(gòu)當(dāng)中比較Notch與APP穿膜區(qū)片段的表面特征揭示了研發(fā)這種特異性抑制劑的潛在的結(jié)合位點(diǎn)。有很多與阿爾茲海默癥相關(guān)的突變集中在γ-分泌酶的活性亞基PS1和底物APP上，其中有一些位點(diǎn)是同一位點(diǎn)突變?yōu)槎鄠€(gè)氨基酸的，該研究中通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)這些對(duì)應(yīng)的反復(fù)突變大多集中于γ-分泌酶與APP相互作用界面上，文章還據(jù)此分類(lèi)討論了這些突變可能影響底物結(jié)合的機(jī)理。
清華大學(xué)生命學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心施一公教授是兩篇研究論文的通訊作者。生命學(xué)院博士后、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者楊光輝、周瑞為兩篇論文的共同第一作者。原清華大學(xué)生命學(xué)院副研究員周強(qiáng)博士，清華大學(xué)生命學(xué)院一年級(jí)博士生郭雪飛參與了這兩項(xiàng)研究，清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)的雷建林博士對(duì)數(shù)據(jù)收集進(jìn)行了指導(dǎo)。清華大學(xué)生命學(xué)院博士后、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者閆創(chuàng)業(yè)以及生命學(xué)院柯檬博士參與《自然》雜志相關(guān)報(bào)道的研究。國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)和清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)分別為該研究的數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)處理提供了支持，冷凍電鏡平臺(tái)的李曉敏對(duì)數(shù)據(jù)收集提供了幫助。北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心（清華）、生命科學(xué)聯(lián)合中心（清華大學(xué)）、科技部和基金委為該研究提供了經(jīng)費(fèi)支持。
圖1： γ-分泌酶結(jié)合Notch復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。a. γ-分泌酶結(jié)合Notch復(fù)合物的密度圖。其中橙色標(biāo)記的為結(jié)合的Notch；b. γ-分泌酶結(jié)合Notch復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型；c. 底物結(jié)合與不結(jié)合狀態(tài)下催化亞基PS1的結(jié)構(gòu)比較，灰白色為未結(jié)合底物的狀態(tài)，青色和藍(lán)色為結(jié)合底物的狀態(tài)，藍(lán)色部分為發(fā)生變化的主要區(qū)域； d. PS1與底物跨膜區(qū)靠近細(xì)胞膜一側(cè)形成β折疊片，從而穩(wěn)定結(jié)合底物；e-f. 與γ-分泌酶結(jié)合后底物Notch發(fā)生的構(gòu)象變化。橙色為結(jié)合在γ-分泌酶中的Notch構(gòu)象，灰白色為未結(jié)合的構(gòu)象。
圖2：γ-分泌酶結(jié)合APP復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。a. γ-分泌酶結(jié)合APP復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型；b. PS1與底物APP所形成的β折疊片結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)來(lái)源于底物，另外兩個(gè)片層來(lái)源于PS1；c. APP與Notch跨膜區(qū)結(jié)合γ-分泌酶狀態(tài)下表面特征比較，可以觀察到兩種底物的具體區(qū)別；d. APP與γ-分泌酶催化亞基PS1跨膜區(qū)中部分與阿爾茲海默癥相關(guān)突變分布。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-018-0813-8
http://science.sciencemag.org/content/early/2019/01/08/science.aaw0930
相關(guān)論文：
1. X. Li et al., Structure of a presenilin family intramembrane aspartate protease.Nature 493, 56, (2013)
2. P. Lu et al., Three-dimensional structure of human γ-secretase. Nature 512, 166, (2014)
3. T. Xie et al., Crystal structure of the γ-secretase component nicastrin. PNAS 111(37) , (2014)
4. S. Dang et al., Cleavage of amyloid precursor protein by an archaeal presenilin homologue PSH. PNAS 112 (11) , (2015)
5. L. Sun et al., Structural basis of human γ-secretase assembly. PNAS 112 (19) , (2015)
6. X. Bai et al., An atomic structure of human γ-secretase. Nature 525, 212, (2015)
7. L. Sun et al., Analysis of 138 pathogenic mutations in presenilin-1 on the in vitro production of Aβ42 and Aβ40 peptides by γ-secretase. PNAS 114 (4) , (2017)
8. R. Zhou et al., Dominant negative effect of the loss-of-function γ-secretase mutants on the wild-type enzyme through heterooligomerization. PNAS 114 (48) , (2017)
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