?????? 來(lái)自上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院陶生策團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)研究院戴俊彪團(tuán)隊(duì)以蛋白質(zhì)芯片為載體、以釀酒酵母作為研究對(duì)象，結(jié)合組蛋白標(biāo)記特異性抗體，發(fā)展了一套簡(jiǎn)便通用的重要蛋白上游蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)。這項(xiàng)研究成果于 2018年 6 月 5 日在 Molecular & Cellular Proteomics （MCP）上在線發(fā)表。
?????? 作為生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，蛋白質(zhì)的含量和翻譯后修飾的改變都會(huì)影響其功能，從而影響生命進(jìn)程并導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此了解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)如何被調(diào)控對(duì)于我們理解生命過(guò)程意義重大。探索特定蛋白/基因與靶蛋白的關(guān)系通常采用基因擾動(dòng)的方法改變基因的表達(dá)水平，檢測(cè)其對(duì)靶蛋白的含量和/或翻譯后修飾水平的影響，從而獲得該蛋白/基因?qū)Π械鞍椎恼{(diào)控關(guān)系。
?????? 組蛋白是細(xì)胞內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)類型之一，是核小體的重要組成部分，而核小體是染色體的構(gòu)成單位。組蛋白能夠被多種小分子基團(tuán)，如甲基和乙?；?，進(jìn)行修飾，從而改變其與DNA和其他蛋白質(zhì)的相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄激活，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，如細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和X染色體失活等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的組蛋白修飾類型已達(dá)21種，而特定位點(diǎn)的特定修飾，即組蛋白標(biāo)記（histone mark）種類已有500多種。對(duì)于這些組蛋白標(biāo)記在體內(nèi)是怎樣被精確調(diào)控卻知之甚少。
?????? 在本研究中，研究人員以釀酒酵母非必需基因敲除庫(kù)和必需基因的溫度敏感突變庫(kù)的細(xì)胞裂解液為樣本，構(gòu)建了一張包含5,159個(gè)單基因敲除/突變菌株的細(xì)胞裂解液芯片，覆蓋82%的酵母基因組。為了驗(yàn)證該芯片可以應(yīng)用于組蛋白標(biāo)記的調(diào)控蛋白的全局性發(fā)現(xiàn)研究，研究人員以兩個(gè)研究得較為清楚的組蛋白標(biāo)記H3K4三甲基化和H3K36三甲基化為例，通過(guò)簡(jiǎn)單的芯片實(shí)驗(yàn)找到了80%以上的已知調(diào)控蛋白。隨后，通過(guò)H4K16乙酰化抗體的芯片實(shí)驗(yàn)，找到了兩個(gè)調(diào)控蛋白Cab4p 和 Cab5p。它們參與 CoA 的合成，分別催化CoA合成通路中的最后兩步。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)蛋白對(duì)多種酰化都有全局性影響，包括 H3K56 和 H4K8 位的乙?；4K12 位的丙?；3K9 位的丁?；?、H3K14 和 H4K12 位的巴豆酰化以及 H4K16 位的 β-羥基丁?；?。質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了組蛋白?；揎椝降慕档褪桥c胞內(nèi) CoA 及?；?CoA 含量的降低相關(guān)。同時(shí)，通過(guò)三個(gè)芯片實(shí)驗(yàn)建立了三個(gè)組蛋白標(biāo)記的上游調(diào)控蛋白網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合已有的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，獲得了三張以組蛋白標(biāo)記為中心的上下游蛋白調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。
?????? 綜上所述，本研究開發(fā)了一套全局性發(fā)現(xiàn)組蛋白標(biāo)記調(diào)控蛋白的細(xì)胞裂解液芯片技術(shù)（Cell Lysate mICroarray on Kilo-conditions，CLICK），該方法能夠從基因組水平對(duì)影響組蛋白標(biāo)記的蛋白進(jìn)行全局性發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，該方法也具有普適性，并不僅僅局限于組蛋白標(biāo)記領(lǐng)域，還適用于尋找任意釀酒酵母蛋白翻譯后修飾的調(diào)控蛋白，并且該方法的指導(dǎo)思想也同樣適用于其它物種的重要蛋白及翻譯后修飾調(diào)控蛋白的發(fā)現(xiàn)。
?????? 上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院陶生策研究員與中科院深圳先進(jìn)研究院戴俊彪研究員為本文通訊作者。陶生策團(tuán)隊(duì)博士生程莉?yàn)楸疚牡谝蛔髡?。陶生策研究員的主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)芯片技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，建立了系列特色蛋白質(zhì)芯片技術(shù)平臺(tái)，并在其基礎(chǔ)上開展了與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的系統(tǒng)性研究。
?????? 該項(xiàng)研究得到了十三五蛋白質(zhì)機(jī)器與生命過(guò)程調(diào)控重點(diǎn)專項(xiàng)、國(guó)家“十二五”傳染病重大專項(xiàng)以及國(guó)家自然科學(xué)基金等資助。
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Cell Lysate Microarray for Mapping the Network of Genetic Regulators for Histone Marks
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Abstract
Proteins, as the major executer for cell progresses and functions, its abundance and the level of post-translational modifications, are tightly monitored by regulators. Genetic perturbation could help us to understand the relationships between genes and protein functions. Herein, to explore the impact of the genome-wide interruption on certain protein, we developed a cell lysate microarray on kilo-conditions (CLICK) with 4,837 knockout (YKO) and 322 temperature-sensitive (ts) mutant strains of yeast (Saccharomyces cerevisiae). Taking histone marks as examples, a general workflow was established for the global identification of upstream regulators. Through a single CLICK array test, we obtained a series of regulators for H3K4me3, which covers most of the known regulators in S.accharomyces. We also noted that several group of proteins that are involved in negatively regulation of H3K4me3. Further, we discovered that Cab4p and Cab5p, two key enzymes of CoA biosynthesis, play central roles in histone acylation. Because of its general applicability, CLICK array could be easily adopted to rapid and global identification of upstream protein/enzyme(s) that regulate/modify the level of a protein or the posttranslational modification of a non-histone protein.
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全文鏈接：http://www.mcponline.org/content/early/2018/06/05/mcp.RA117.000550.abstract
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作者：程莉
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