?????? 2018年7月19日，上海交通大學系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院比較生物醫(yī)學研究中心吳強教授課題組在國際著名期刊Molecular Cell《分子細胞》上在線發(fā)表了題為“Precise and Predictable CRISPR Chromosomal Rearrangements Reveal Principles of Cas9-mediated Nucleotide Insertion《精準且可預測的CRISPR染色體重排揭示Cas9介導的堿基插入規(guī)律》”的最新研究成果，在基因編輯機制方面取得了原始創(chuàng)新性進展，顛覆了已有的基因編輯認識。揭示了CRISPR/Cas9新一代基因編輯系統(tǒng)全新的切割機理及其在染色體重排和DNA修復中的作用，實現(xiàn)了精準的DNA大片段編輯及可預測的堿基插入。
?????? CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年國際上興起的新一代基因編輯技術。這一劃時代技術雖然起源于細菌和古生菌，但在真菌及高等動物植物基因組改造中，以及農(nóng)業(yè)科學、生命醫(yī)學、新藥創(chuàng)制等“卡脖子”領域已得到了迅速而廣泛的應用。近年來，借助我國物種多樣性這一優(yōu)勢，國內(nèi)基因編輯研究工作獲得了空前的發(fā)展，取得了一系列重要進展，在多個物種的基因編輯技術領域?qū)崿F(xiàn)了國際“并跑”到“領跑”的轉(zhuǎn)變。國際上的基因編輯應用研究如火如荼，但對Cas9核酸酶的切割原理和修復機制研究還比較少。
?????? 從基因打靶技術在2007年獲得諾貝爾獎后，2012年開始發(fā)展起來的CRISPR/Cas9基因編輯技術是最具潛力獲得諾貝爾獎的。自從這一新一代基因編輯系統(tǒng)建立以來，人們普遍認為Cas9核酸酶切割DNA雙鏈是產(chǎn)生平頭末端的。特別是早在2012年，CRISPR/Cas9研究的先驅(qū)杜德娜（Doudna）和夏龐蒂埃（Charpentier）發(fā)表在Science的研究論文，以及Siksnys發(fā)表在PNAS的研究論文，發(fā)現(xiàn)Cas9切割DNA產(chǎn)生平頭末端，前者進一步報道體外斷裂實驗所觀察到的現(xiàn)象是由于Cas9核酸酶的核酸外切活性所導致的，Cas9具有核酸外切酶活性。
?????? 上海交大吳強團隊通過開發(fā)DNA片段編輯技術，結合高通量測序技術及蛋白質(zhì)工程技術，發(fā)現(xiàn)Cas9核酸酶通過核酸內(nèi)切酶活性切割DNA雙鏈能夠產(chǎn)生突出末端，而不僅僅是之前報道的平頭末端切割方式，Cas9不具有核酸外切酶活性，而僅具有核酸內(nèi)切酶活性。同時發(fā)現(xiàn)通過基因工程改造后的Cas9核酸酶具有不同的突出末端切割模式，從Cas9核酸酶的結構上更進一步證明了Cas9切割的多樣性。綜上所述，該研究從根本上顛覆了人們對Cas9核酸酶切割DNA的既有認識，可能成為CRISPR/Cas9新一代基因編輯系統(tǒng)基礎研究具有轉(zhuǎn)折意義的發(fā)現(xiàn)和原始創(chuàng)新，為優(yōu)化和改造基因編輯技術奠定了堅實基礎。
?????? 腫瘤疾病是目前困擾人類的最大難題之一，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多基因且與環(huán)境共同作用的結果。染色體重排在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關重要，例如治療白血病的“神藥”格列衛(wèi)的原始靶點就是由染色體重排產(chǎn)生的。染色體重排包括染色體的大片段缺失、反轉(zhuǎn)、重復和易位等，通常與惡性腫瘤密切相關。當三維基因組染色體結構變異發(fā)生在基因的編碼區(qū)時，會造成基因的異位或非正常表達，或引起基因拷貝數(shù)的變化，從而影響基因調(diào)控和基因功能。當染色體結構變異發(fā)生在基因的非編碼區(qū)時，也會通過長距離染色質(zhì)環(huán)化的改變，進一步影響三維基因組染色質(zhì)高級結構異常，從而造成基因調(diào)控與基因功能的改變。最近新興的基因編輯和DNA片段編輯技術為三維基因組染色體異常等相關疾病的根本病因的研究和最終治療手段提供了重要技術支持。尤其是利用CRISPR基因編輯技術構建特定的三維基因組染色體結構變異疾病模型，能夠極大的促進對惡性腫瘤的發(fā)生機制及治療手段的研究，同時理解染色體異常的DNA損傷修復機制也能為潛在的腫瘤治療手段提供支持。
?????? 吳強團隊長期致力于利用基因打靶和基因編輯技術研究基因組DNA大片段敲除或編輯。早在2015年，課題組博士生李金環(huán)和壽佳合作發(fā)表了關于DNA片段編輯的研究工作，闡述了利用CRISPR雙切點的DNA片段編輯機制，開發(fā)了基因組DNA大片段編輯技術，包括反轉(zhuǎn)基因調(diào)控元件、敲除基因簇、重復DNA片段等。這種技術方法比傳統(tǒng)的通過同源重組獲得的DNA片段重排方法更為高效，為研究三維基因組大量未知元件的調(diào)控機制以及癌細胞染色質(zhì)高級結構的變異提供了便利手段。同年，該團隊利用這一DNA片段遺傳編輯技術對基因組特定遺傳元件進行反轉(zhuǎn)，結合計算生物學，發(fā)現(xiàn)了CTCF位點和方向在三維基因組染色質(zhì)高級結構折疊的重要規(guī)律，相關研究結果發(fā)表在Cell雜志上。課題組利用基因編輯技術研究原鈣粘蛋白腦發(fā)育功能也獲得了重要進展，于2018年6月份發(fā)表于eLife雜志上。
?????? 該研究在前期工作積累的基礎上，在Cas9核酸酶的切割原理及細胞的DNA損傷修復機制方面取得了原始創(chuàng)新，顛覆了該研究領域的原有認知。CRISPR基因編輯工具利用Cas9核酸酶結合靶標特異性RNA分子對基因組DNA特定區(qū)段進行靶向切割，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后在細胞內(nèi)非同源末端連接修復通路的作用下（普遍認為細胞的同源修復通路是精準的，而非同源末端連接修復通路是隨機的），對DNA斷裂末端進行修復，從而造成隨機插入刪除。該研究通過敲除或干擾在癌癥中起到關鍵作用的DNA修復蛋白，能夠顯著提高精準的DNA片段編輯效率，同時證明細胞內(nèi)非同源末端連接修復通路也是一種精準的DNA修復方式。
?????? 此外，該研究利用高通量測序技術對DNA片段編輯的雙鏈斷裂末端進行分析發(fā)現(xiàn)，斷裂末端的核苷酸加入呈現(xiàn)非常有規(guī)律的模式。通過一對導向RNA分子的四種不同切割構型，結合測序技術和基因工程技術，證明Cas9介導的堿基插入在DNA片段編輯中是能夠預測的。這一可預測的染色體重排規(guī)律，為研究人類染色體異常引起腫瘤等相關疾病提供技術支持，進而推動相關領域的發(fā)展。
?????? 該研究獲得了評審專家的高度肯定：“該工作很有趣很有意思，該研究對于預測Cas9介導的DNA片段編輯結果很有幫助”；“DNA大片段編輯的選題以及對DNA修復的意義很有相關性，很有意義，實驗數(shù)據(jù)尤其引人注目，該研究很可能在基因編輯以及構建染色質(zhì)重排的多種疾病模型領域引發(fā)廣泛的興趣”；“該研究為可預測的DNA片段編輯提供了嶄新證據(jù)，實驗設計好，實驗結果質(zhì)量高，Cas9核酸內(nèi)切酶活性切割DNA形成突出末端是一項非常意外的發(fā)現(xiàn)，也是一項重大發(fā)現(xiàn)。”
?????? 總之，該研究首次開發(fā)了通過調(diào)控細胞修復系統(tǒng)實現(xiàn)精準的DNA片段編輯方法，以及通過研究DNA片段編輯接頭處的特定堿基加入，從而實現(xiàn)了可預測的DNA片段編輯。這項研究為進一步理解DNA雙鏈斷裂修復機制，以及三維基因組DNA片段的編輯應用奠定了重要基礎。在基因組編輯工具CRISPR技術飛速發(fā)展的今天，該研究系統(tǒng)的闡述了如何利用細胞內(nèi)修復蛋白介導精準的DNA片段編輯，有望推動三維基因組染色體異常等遺傳疾病的相關研究。
?????? 該研究由上海交通大學獨立完成，吳強為通訊作者，交大博士生壽佳和博士后李金環(huán)為共同第一作者。該研究得到國家自然科學基金委員會和科技部的資助。
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論文鏈接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(18)30466-0
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作者：壽佳，李金環(huán)
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