上海交大吳強(qiáng)課題組致遠(yuǎn)榮譽(yù)計(jì)劃2019級(jí)博士生石欣發(fā)現(xiàn)基因編輯新切割方式
?????? 2019年10月1 日，上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院比較生物醫(yī)學(xué)中心吳強(qiáng)課題組在基因編輯領(lǐng)域又取得新進(jìn)展，國際著名OA學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞發(fā)現(xiàn)》發(fā)表了題為“Cas9 has no exonuclease activity resulting in staggered cleavage with overhangs and predictable di- and tri-nucleotide CRISPR insertions without template donor”的最新研究成果。該研究發(fā)現(xiàn)了SpCas9新的切割方式，并首次提出SpCas9沒有外切酶活性。
?????? 基因編輯在生物醫(yī)藥和生命信息等領(lǐng)域中一直扮演著重要的角色，但傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)由于構(gòu)造困難因此在一定程度上阻礙了它的發(fā)展，而CRISPR/Cas9技術(shù)的問世則很好的克服了這一缺點(diǎn)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌的一種天然免疫系統(tǒng)。當(dāng)外源核酸入侵時(shí)，Cas9蛋白就會(huì)在RNA的介導(dǎo)下定向切割核酸，發(fā)揮免疫功能。經(jīng)過改造后的第三代基因編輯工具CRISPR/Cas9因其簡單，高效，低廉等優(yōu)點(diǎn)為廣大科研工作者所利用。但即便如此，人們對(duì)Cas9蛋白的切割機(jī)制和切割后的修復(fù)機(jī)制還知之甚少。
?????? 在以往的研究中，以CRISPR/Cas9領(lǐng)域的權(quán)威杜德娜（Doudna）和夏龐蒂埃（Charpentier）為代表的科學(xué)家們普遍認(rèn)為Cas9只能在PAM位點(diǎn)上游3堿基處切割DNA雙鏈產(chǎn)生平末端，并把在體外切割實(shí)驗(yàn)中觀察到的長短不一的切割產(chǎn)物解釋為Cas9的核酸外切酶活性。但近年來隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明Cas9蛋白存在切割產(chǎn)生粘性末端的活性。這一顛覆性成果由吳強(qiáng)課題組首先取得，相關(guān)文章于2018年8月正式發(fā)表在國際權(quán)威期刊Molecular Cell《分子細(xì)胞》上，該文章第一次明確提出Cas9存在在非互補(bǔ)鏈PAM位點(diǎn)上游4堿基處切割產(chǎn)生粘性末端的活性，顛覆了傳統(tǒng)的認(rèn)知。
?????? 雖然Cas9在PAM位點(diǎn)上游4堿基處切割產(chǎn)生粘性末端的活性已經(jīng)得到了承認(rèn)，但對(duì)于Cas9是否存在其他的切割活性仍然存在爭議。圍繞這一問題，吳強(qiáng)課題組致遠(yuǎn)榮譽(yù)計(jì)劃2019級(jí)博士生石欣和博士后壽佳利用一對(duì)sgRNA對(duì)DNA片段進(jìn)行編輯，并對(duì)重排接口進(jìn)行了高通量測序分析。結(jié)果表明不僅單堿基的插入存在著規(guī)律，兩堿基甚至三堿基的插入也同樣存在著相似的規(guī)律且這種插入可以精準(zhǔn)預(yù)測：它們由PAM位點(diǎn)上游-4，-5，-6位堿基所決定。這種規(guī)律性的兩堿基，三堿基的插入暗示SpCas9存在著PAM位點(diǎn)上游-5，-6位切割的活性，這種新的發(fā)現(xiàn)作為一種補(bǔ)充，不僅擴(kuò)大了人們對(duì)于SpCas9切割活性的認(rèn)知，還從另一側(cè)面驗(yàn)證了Cas9的在PAM位點(diǎn)上游4堿基處切割的活性。至此，吳強(qiáng)課題組修改了現(xiàn)有的模型，并提出了新的切割連接模型。
?????? 為了進(jìn)一步直觀地驗(yàn)證這種新的切割活性，石欣和壽佳還進(jìn)行了體外切割實(shí)驗(yàn)并對(duì)切割產(chǎn)物進(jìn)行了高通量測序分析，結(jié)果表明對(duì)于非互補(bǔ)鏈，Cas9切割后產(chǎn)生了不同長度的突出末端的切割產(chǎn)物，即產(chǎn)生了一個(gè)堿基，兩個(gè)堿基，三個(gè)堿基的5’突出末端。而對(duì)于互補(bǔ)鏈，切割產(chǎn)物長度一致。這一體外實(shí)驗(yàn)不僅更直觀地表明Cas9在非互補(bǔ)鏈PAM位點(diǎn)上游-4，-5，-6位的切割活性，還對(duì)互補(bǔ)鏈的切割只發(fā)生在PAM位點(diǎn)上游3堿基處進(jìn)行了驗(yàn)證。值得注意的是，該研究第一次在體外切割實(shí)驗(yàn)中直觀地證實(shí)了Cas9的產(chǎn)生粘性末端的切割活性。
?????? 總之，該研究首次證明了Cas9在非互補(bǔ)鏈PAM位點(diǎn)上游-5，-6的切割活性，并否定了此前認(rèn)為的不同長度的切割產(chǎn)物是由于Cas9存在外切酶活性所致這一假設(shè)。不僅如此，該項(xiàng)研究還為精確可控的兩堿基、三堿基的基因編輯奠定了基礎(chǔ)，并為人類遺傳疾病的治療提供了潛在的方向。在基因編輯如火如荼的今天，使用單個(gè)sgRNA切割造成基因失活早就成為常態(tài)，但利用一對(duì)sgRNA對(duì)DNA大片段進(jìn)行編輯，并將其用于基因組元件及染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)方面的研究還并未成熟。可以預(yù)見，該研究不僅為基礎(chǔ)研究發(fā)揮重大作用，同時(shí)還有望推動(dòng)精確基因編輯及細(xì)胞修復(fù)機(jī)制的進(jìn)一步深入理解。
?????? 吳強(qiáng)課題組長期致力于基因編輯技術(shù)的研究，尤其關(guān)注于DNA大片段編輯。在2015年，課題組博士李金環(huán)和壽佳就在《分子細(xì)胞生物學(xué)》雜志發(fā)表了關(guān)于DNA大片段編輯的一系列系統(tǒng)性的工作。通過一對(duì)sgRNA的使用，產(chǎn)生的兩個(gè)四個(gè)斷裂末端連接后會(huì)產(chǎn)生包括DNA片段刪除，反轉(zhuǎn)，重復(fù)，易位等重排結(jié)果。課題組開發(fā)的DNA大片段編輯技術(shù)不僅方便了基因組元件功能的研究，還為疾病模型的建立提供便利。同年，吳強(qiáng)課題組利用DNA大片段編輯技術(shù)研究了CTCF蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的方向性與染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，通過對(duì)CTCF結(jié)合位點(diǎn)的反轉(zhuǎn)，結(jié)合計(jì)算生物學(xué)揭示了CTCF蛋白結(jié)合位點(diǎn)的方向性在染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)中的重要規(guī)律，相關(guān)結(jié)果發(fā)表在國際頂級(jí)期刊Cell《細(xì)胞》上。不僅如此，課題組還利用DNA大片段編輯技術(shù)對(duì)原鈣粘蛋白腦發(fā)育功能進(jìn)行了研究，相關(guān)進(jìn)展于2018年6月發(fā)表在eLife上。
?????? 上海交通大學(xué)吳強(qiáng)為通訊作者，交大致遠(yuǎn)榮譽(yù)計(jì)劃2019級(jí)博士生石欣和博士后壽佳為共同第一作者，石欣同學(xué)今年6月以優(yōu)異成績畢業(yè)于南開大學(xué)，于九月正式到上海交大報(bào)到。該研究得到國家自然科學(xué)基金委員會(huì)和科技部的資助。
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