清華大學(xué)生命學(xué)院隋森芳課題組在Science Advances發(fā)文報(bào)道在突觸囊泡與質(zhì)膜融合導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的SNARE復(fù)合體的解聚機(jī)制
2019年4月10日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院隋森芳教授研究組在《科學(xué)●進(jìn)展》（Science Advances）期刊上在線發(fā)表題為"SNARE復(fù)合體解聚的機(jī)制研究"（Mechanistic insights into the SNARE complex disassembly）的研究論文，通過(guò)解析SNARE解聚分子機(jī)器20S復(fù)合體的高分辨率冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)，并結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)、電生理實(shí)驗(yàn)和交聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，揭示了SNARE復(fù)合體的解聚機(jī)制。
膜融合是生命基本和重要的過(guò)程之一，真核細(xì)胞多種形式的胞內(nèi)區(qū)間具有不同的生物化學(xué)性質(zhì)，細(xì)胞維持這些胞內(nèi)分區(qū)之間的動(dòng)態(tài)平衡主要依賴的是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，該過(guò)程與許多重要疾病密切相關(guān)。囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)即包含轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的囊泡從供體出芽然后轉(zhuǎn)移至目標(biāo)膜，錨定之后與目標(biāo)膜融合，從而使得膜蛋白、磷脂和內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)至另一個(gè)細(xì)胞區(qū)間。神經(jīng)遞質(zhì)的釋放就是通過(guò)突觸囊泡與質(zhì)膜的融合實(shí)現(xiàn)的。位于囊泡膜上的v-SNARE蛋白和位于目標(biāo)膜上的t-SNARE蛋白在形成SNARE復(fù)合體的過(guò)程中將兩膜拉近并驅(qū)動(dòng)膜融合的發(fā)生。SNARE復(fù)合體是非常穩(wěn)定的四螺旋束結(jié)構(gòu)，必須被解聚成單體以便循環(huán)使用，在細(xì)胞內(nèi)這是通過(guò)馬達(dá)蛋白NSF及其接頭蛋白SNAP共同完成的。NSF蛋白是一種多細(xì)胞功能相關(guān)的ATP酶（AAA+ ATPase），它與接頭蛋白SNAP、SNARE復(fù)合體一起形成沉降系數(shù)為20S的復(fù)合體。在20S復(fù)合體中，NSF在SNAP的幫助下利用水解ATP產(chǎn)生的能量將SNARE復(fù)合體解開(kāi)成單體，使胞內(nèi)膜融合的過(guò)程得以循環(huán)進(jìn)行。20S復(fù)合體是一個(gè)非常高效的分子機(jī)器，對(duì)其工作機(jī)制的研究不僅有助于深入理解胞內(nèi)SNARE的循環(huán)利用機(jī)制及膜融合的調(diào)控機(jī)制，也對(duì)揭示AAA+ ATPase酶的分子機(jī)理具有重要的意義，因此一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
隋森芳教授研究組長(zhǎng)期致力于利用冷凍電鏡技術(shù)研究與生物膜相關(guān)的重要蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能。此前，曾于2012年在《自然結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)》（Nature Structural & Molecular Biology）期刊上報(bào)道了全長(zhǎng)NSF蛋白在水解ATP過(guò)程中各個(gè)狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)以及20S復(fù)合體的負(fù)染電鏡三維結(jié)構(gòu)。隨后，又于2015年在《細(xì)胞研究》（Cell Research）期刊上報(bào)道了20S復(fù)合體的低分辨率冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)和SNAP-SNARE亞組裝體中等分辨率的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了新的解聚關(guān)鍵氨基酸。在此次發(fā)表的《科學(xué)●進(jìn)展》論文中，研究人員通過(guò)優(yōu)化冷凍樣品制備條件將錨定在納米盤（Nanodisc，模擬細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層）上的20S復(fù)合體的分辨率推進(jìn)至4.6 
，并進(jìn)一步通過(guò)分割重構(gòu)法將NSF六聚體和α-SNAP-SNARE亞組裝體的分辨率提高到3.9 和3.7 （圖1）。
圖1 α-SNAP-SNARE部分電鏡結(jié)構(gòu)的分辨率分布和典型氨基酸殘基的密度圖。
這些高分辨率結(jié)構(gòu)揭示了20S復(fù)合物中蛋白質(zhì)相互作用的許多細(xì)節(jié)。結(jié)合生化分析，研究者發(fā)現(xiàn)在SNARE解聚過(guò)程中，α-SNAPs主要通過(guò)R116殘基的靜電作用和L197殘基的疏水作用對(duì)VAMP單鏈的兩個(gè)位點(diǎn)施加作用力。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)R116和L197在體內(nèi)的功能相關(guān)性，研究者與清華大學(xué)生命學(xué)院姚駿老師課題組合作檢測(cè)了這些突變體對(duì)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)的影響。結(jié)果表明，與野生型α-SNAP過(guò)表達(dá)相比，R116A和L197A顯著降低了突觸小泡的釋放速度，表明這兩個(gè)突變體可能通過(guò)降低SNARE復(fù)合物的解聚能力而顯著削弱了膜融合（圖2）。
圖2 電生理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)α-SNAP的R116殘基和L197殘基的功能。
此外結(jié)合交聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，研究者證明了SNARE螺旋束的氨基末端與NSF-D1結(jié)構(gòu)域的中心孔環(huán)之間有直接相互作用，并驗(yàn)證了這種相互作用可能作為錨定支點(diǎn)在SNARE復(fù)合體的解聚中發(fā)揮重要作用。該研究提供了一個(gè)詳細(xì)的α-SNAP介導(dǎo)的SNARE復(fù)合體解聚的旋轉(zhuǎn)模型（圖3）：NSF利用ATP水解產(chǎn)生的能量帶動(dòng)α-SNAP圓筒沿右手方向旋轉(zhuǎn)從而對(duì)SNARE復(fù)合體的左手方向螺旋束施加解旋方向的切線力——主要來(lái)自于α-SNAP蛋白的 R116殘基與VAMP蛋白的E62和D68殘基的靜電作用以及α-SNAP蛋白的L197殘基與VAMP蛋白的V48、V50和L54殘基的疏水作用。同時(shí)由于SNARE復(fù)合物的N端直接錨定在NSF-D1的孔區(qū)，右手扭矩將開(kāi)始展開(kāi)和/或破壞左手螺旋的SNARE復(fù)合物，從而同時(shí)或連續(xù)地將復(fù)合物分解成單個(gè)蛋白質(zhì)。
圖3 SNARE復(fù)合體解聚的模型。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院隋森芳教授為本文的通訊作者；生命科學(xué)學(xué)院已畢業(yè)博士生黃軒（現(xiàn)為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心研究實(shí)習(xí)員）、生命科學(xué)學(xué)院孫珊副研究員、生命科學(xué)學(xué)院已畢業(yè)博士生王霄婧、生命科學(xué)學(xué)院前助研樊鳳輝為本文的共同第一作者。生命科學(xué)學(xué)院博士后周強(qiáng)（現(xiàn)為西湖大學(xué)特聘研究員）參與了電鏡數(shù)據(jù)分析；生命科學(xué)學(xué)院姚駿課題組進(jìn)行了電生理實(shí)驗(yàn)；北京生命科學(xué)研究所董夢(mèng)秋研究員課題組進(jìn)行了交聯(lián)質(zhì)譜的工作。國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（北京）設(shè)施清華基地冷凍電鏡平臺(tái)和計(jì)算平臺(tái)，以及清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)為數(shù)據(jù)收集和處理提供了支持。膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金等為本研究提供了經(jīng)費(fèi)支持。
原文鏈接：https://advances.sciencemag.org/content/5/4/eaau8164
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