我院蔡宇伽團(tuán)隊(duì)研發(fā)VLP-mRNA遞送技術(shù)：打通基因編輯體內(nèi)治療的最后一公里
?????? 1月5日，上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院的蔡宇伽團(tuán)隊(duì)在《自然-生物醫(yī)學(xué)工程》（Nature Biomedical Engineering）雜志上發(fā)表了一篇題為：Lentiviral delivery of co-packaged Cas9 mRNA and a Vegfa-targeting guide RNA prevents wet age-related macular degeneration in mice的研究論文，發(fā)明了一種介于病毒載體與非病毒載體之間的類(lèi)病毒體（virus-like particle, VLP）遞送技術(shù)。VLP可以遞送CRISPR/Cas9 mRNA, 實(shí)現(xiàn)安全和高效的體內(nèi)基因編輯。值得一提的是，該技術(shù)是我國(guó)首個(gè)完全自主開(kāi)發(fā)的原創(chuàng)型基因治療載體，體現(xiàn)了我國(guó)在基因治療領(lǐng)域的科技進(jìn)步。
?????? 自最早的基因編輯工具問(wèn)世至今，基因編輯技術(shù)已經(jīng)有近30年的歷史了。特別是2012年以來(lái)，隨著CRISPR的橫空出世，基因編輯技術(shù)日漸趨于成熟。然而遺憾的是，相對(duì)于基因編輯工具本身的快速進(jìn)化，其遞送技術(shù)的發(fā)展極其緩慢和困難。而遞送之于基因編輯治療的重要性如同火箭之于登月。由于遞送技術(shù)的滯后發(fā)展，體內(nèi)基因編輯治療的臨床應(yīng)用困難重重，整個(gè)領(lǐng)域都在期待遞送技術(shù)的突破。
?????? 諾獎(jiǎng)得主Jennifer Doudna在2020年初給Nature雜志撰寫(xiě)的綜述中，系統(tǒng)論述了基因編輯治療的前景和挑戰(zhàn)。在展望CRISPR美好應(yīng)用前景的同時(shí)，這位今年的諾獎(jiǎng)得主發(fā)出了‘遞送可能仍然是基因編輯體細(xì)胞治療的最大瓶頸’的感嘆（Delivery remains perhaps the biggest bottleneck to somatic-cell genome editing）。
?????? 近幾年來(lái)，基因編輯工具本身的發(fā)展令人眼花繚亂，各種Cas9變體、堿基編輯工具及其變體、Prime Editor等，層出不窮。但是，這些工具的臨床應(yīng)用必須回歸到遞送，而迄今為止可選的遞送工具還是有幾十年歷史的‘老三件’：AAV、慢病毒以及納米材料。盡管這些遞送載體廣泛用于基礎(chǔ)研究，但它們卻不適合直接用于臨床。基因編輯的臨床應(yīng)用有著安全性和有效性的雙重標(biāo)準(zhǔn)。一方面，病毒載體由于長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)基因編輯酶，會(huì)帶來(lái)安全性上的不確定性；另一方面，納米材料則面臨效率上的挑戰(zhàn)。2020年上半年，張峰作為創(chuàng)始人的著名基因編輯治療科技型企業(yè)Editas實(shí)施了首例人體基因編輯治療的臨床研究(Nature Biotechnology volume 38, page382(2020))。但由于該研究使用AAV作為載體，CRISPR將長(zhǎng)期與患者共存，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。理想的基因編輯遞送工具需要兼具瞬時(shí)和高效的特點(diǎn)，以確保治療的安全性和有效性。
?????? 慢病毒載體可以高效感染幾乎所有的細(xì)胞，而非病毒成分mRNA具有瞬時(shí)性的特點(diǎn)。蔡宇伽團(tuán)隊(duì)利用mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)與噬菌體衣殼蛋白特異識(shí)別的原理，通過(guò)病毒工程技術(shù)，將兩者的優(yōu)點(diǎn)完美的結(jié)合起來(lái)，創(chuàng)造了新型遞送技術(shù)VLP-mRNA。通過(guò)VLP-mRNA遞送Cas9 mRNA, Cas9的存在時(shí)間只有72小時(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，與長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)Cas9的病毒系統(tǒng)相比，VLP mRNA可以顯著降低、甚至完全避免脫靶效應(yīng)。另外，VLP mRNA可以遞送整個(gè)CRISPR元件（Cas9與gRNA）,克服了AAV載體運(yùn)載能力小的限制，甚至可以遞送更大的堿基編輯工具。
?????? 蔡宇伽團(tuán)隊(duì)研究人員還將VLP-mRNA技術(shù)用于眼科疾病的治療。老年性黃斑變性（AMD）是一種退行性眼底疾病。患者表現(xiàn)為中心視力下降、視物變形、周邊部或中心視野出現(xiàn)暗點(diǎn),對(duì)老年人的生活 質(zhì)量造成極大的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì),西方發(fā)達(dá)國(guó)家中 70 歲 以上的老年人罹患 AMD 者超過(guò) 40%。隨著我國(guó)老年人口日漸增多,黃斑變性的發(fā)病率也越來(lái)越高。另外，糖尿病患者也可能罹糖尿病相關(guān)黃斑變性，總體發(fā)病率在10%左右。目前，黃斑變性的治療方法是VEGF單克隆抗體。然而，抗體需要反復(fù)給藥；另外，抗體外溢可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。
?????? 研究團(tuán)隊(duì)利用激光誘導(dǎo)的小鼠黃斑變性模型，通過(guò)視網(wǎng)膜下腔注射的方式，發(fā)現(xiàn)CRISPR特異性的分布在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE），而RPE 細(xì)胞是眼內(nèi)VEGF的主要來(lái)源。VLP遞送CRISPR實(shí)現(xiàn)了高達(dá)44%的vegfa基因敲除，降低了63%的新生血管面積。第二代測(cè)序表明VLP-mRNA未誘導(dǎo)出脫靶效應(yīng)。對(duì)于此前報(bào)道的AAV遞送CRISPR引起的大片段缺失，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)第三代測(cè)序，僅能發(fā)現(xiàn)勉強(qiáng)高于背景的信號(hào)。值得一提的是，VLP mRNA無(wú)論在體外還是在眼內(nèi)，均未引起免疫反應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力支持了CRISPR在黃斑變性基因治療上的臨床應(yīng)用潛力。
?????? 總的來(lái)說(shuō)，VLP-mRNA是一種通用型的、瞬時(shí)性的CRISPR遞送工具，兼具高效和安全的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)無(wú)疑將幫助CRISPR體內(nèi)基因編輯治療時(shí)代的真正來(lái)臨，為無(wú)藥可治或有藥難治的遺傳性、獲得性以及感染性疾病的患者帶來(lái)新的希望。上海交通大學(xué)博士生凌思凱是本文的第一作者，上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院眼科臨床醫(yī)學(xué)中心的楊仕琪博士、孫曉東教授也為本研究的完成做出了重要貢獻(xiàn)。復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院、瑞金醫(yī)院、中科院、丹麥奧胡斯大學(xué)的科學(xué)家參與了該研究。
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稿件來(lái)源：蔡宇伽課題組
圖文編輯：王華瑤
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