?????? 當(dāng)前全球新冠疫情局勢(shì)依然嚴(yán)峻,感染人數(shù)已超過(guò)9913萬(wàn),死亡人數(shù)已超過(guò)212萬(wàn)人(截至2021年1月25日),然而仍然沒(méi)有針對(duì)新冠的特效藥,控制疫情最重要的手段之一就是執(zhí)行快速,精確的診斷,早發(fā)現(xiàn)早隔離。當(dāng)前新冠感染檢測(cè)技術(shù)是以核酸檢測(cè)為主,但其操作相對(duì)復(fù)雜,而用于監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2特異性IgG和IgM反應(yīng)的免疫學(xué)/血清學(xué)檢測(cè)可提供重要信息,可作為輔助手段以提高新冠感染診斷的準(zhǔn)確性,并用于新冠感染歷史的判斷。
?????? 抗體檢測(cè)的準(zhǔn)確性取決于抗原位點(diǎn)的選取,雖然N蛋白具有較強(qiáng)的抗原性能夠誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高豐度的抗體,但是特異性卻不如S(Spike)蛋白,然而,在制備S蛋白,S1以及RBD時(shí),蛋白質(zhì)正確且高效表達(dá)通常是最困難的一步。病毒蛋白往往具有多個(gè)糖基化位點(diǎn),更增加了蛋白表達(dá)、純化的難度。若能夠找到不需要考慮蛋白結(jié)構(gòu)的肽來(lái)代替完整的蛋白,將大大簡(jiǎn)化免疫檢測(cè)關(guān)鍵材料的準(zhǔn)備,大幅地降低檢測(cè)成本,并有可能在不降低靈敏度的情況下提高特異性。
?????? 2021年1月22日,上海交通大學(xué)陶生策團(tuán)隊(duì)聯(lián)合華中科技大學(xué)范雄林團(tuán)隊(duì)等多家單位于Cellular & Molecular Immunology在線發(fā)表研究成果:Systematic evaluation of the IgG responses to SARS-CoV-2 spike protein-derived peptides for monitoring COVID-19 patients。該研究基于S蛋白全覆蓋肽芯片,分析了大量的血清樣本,鑒定出了幾條具有高診斷性能的S蛋白肽段。
?????? 該團(tuán)隊(duì)前期合成了SARS-CoV-2全套原核表達(dá)克隆并進(jìn)行了無(wú)償分享(為了能讓更多的科學(xué)家方便獲取,該團(tuán)隊(duì)已將這套克隆放到了中科院生化細(xì)胞所蘇州研究院的質(zhì)粒共享平臺(tái)上(http://brics.ac.cn),并授權(quán)他們進(jìn)行后續(xù)分享),并在該表達(dá)克隆庫(kù)的基礎(chǔ)上成功地構(gòu)建了第一款SARS-CoV-2蛋白質(zhì)組芯片(陶生策團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)SARS-CoV-2蛋白質(zhì)組芯片全局性分析新冠病人血清IgG&IgM應(yīng)答)。接著,該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了全覆蓋S蛋白的小肽芯片(BioartReports,2020年4月12日:陶生策團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建新冠病毒S蛋白小肽芯片),利用該芯片對(duì)55例新冠康復(fù)病人的血清以及18例對(duì)照組血清的IgG和IgM抗體響應(yīng)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)多條小肽在病人血清中有較強(qiáng)的信號(hào)。
?????? 在本研究中,該團(tuán)隊(duì)采用S蛋白小肽芯片分析了包括729例住院患者血清樣本和542例對(duì)照血清樣本(包括無(wú)疾病,上呼吸道疾病,自身免疫疾病,肺癌及其他疾?。?,分析后發(fā)現(xiàn)其中8條肽表現(xiàn)出了較高的診斷能力(圖1),其中S2-78(aa 1148-1159)的AUC達(dá)到了0.99——這一結(jié)果僅次于S1蛋白的診斷效果,特異性為96.7%(95%置信區(qū)間94.8-98.0%),靈敏度95.5%(95%置信區(qū)間93.7-96.9%)。不僅如此,S2-78在患者中的診斷正確率也與S1相當(dāng)(圖2),并且與S1和N蛋白同樣適合檢測(cè)抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化。監(jiān)測(cè)無(wú)癥狀感染對(duì)于控制新冠感染是必要的,該團(tuán)隊(duì)分析了63例經(jīng)過(guò)核酸檢測(cè)或抗體檢測(cè)的無(wú)癥狀感染者血清,結(jié)果表明S2-78與S1蛋白的一致性達(dá)到93.7% (圖3)。
圖1. 用于區(qū)分COVID-19組(n = 729)和對(duì)照組(n = 542)的肽或蛋白質(zhì)的ROC曲線
圖2. S2-78與S1蛋白之間的一致性分析
圖3. S2-78用于診斷無(wú)癥狀感染者
?????? 為了驗(yàn)證S2-78的診斷效果,該團(tuán)隊(duì)先將新冠康復(fù)者血清進(jìn)行ELISA驗(yàn)證,信號(hào)值與芯片信號(hào)值之間皮爾森系數(shù)達(dá)到0.926,充分證明了第一階段肽芯片結(jié)果的可靠性;接著,通過(guò)獨(dú)立的血清樣本驗(yàn)證,S2-78同樣展示出對(duì)新冠感染的高診斷力(圖4)。
圖4. S2-78的ELISA驗(yàn)證
?????? 由于7種已知的人類冠狀病毒之間的同源性較高,SARS-CoV-2抗體診斷的一個(gè)不可避免的風(fēng)險(xiǎn)是否與其他冠狀病毒的交叉反應(yīng),尤其是引起普通感冒的4種冠狀病毒。該研究團(tuán)隊(duì)對(duì)診斷能力較強(qiáng)的幾條肽進(jìn)行了同源性分析,嘗試將展現(xiàn)出較低同源性的肽構(gòu)建了一個(gè)組合,并通過(guò)二元回歸分析進(jìn)行初步篩選后,發(fā)現(xiàn)在這些SARS-CoV-2特異性肽中,S1-93(aa 553-564),S1-97(aa 577-588),S1-101(aa 601-612)和S1-105(aa 625-636)可以組合以提高檢測(cè)的特異性(圖5)。
圖5. 組合肽區(qū)分相關(guān)冠狀病毒
?????? 該研究利用完全覆蓋S蛋白的肽芯片,分析了大量的血清樣本,鑒定出了8條具有高診斷價(jià)值的肽作為檢測(cè)SARS-CoV-2特異性抗原,其中S2-78(aa 1148-1159)在檢測(cè)COVID-19和無(wú)癥狀感染方面具有與S1蛋白相當(dāng)?shù)脑\斷性能,當(dāng)增加抗原濃度或采用更敏感的平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)(例如電化學(xué)平臺(tái)或單分子檢測(cè)技術(shù))時(shí),有可能進(jìn)一步提高S2-78的敏感性。據(jù)悉,該團(tuán)隊(duì)正在合作進(jìn)行超靈敏且便攜的檢測(cè)方法的建立,將S2-78作為監(jiān)測(cè)新冠病毒的另一個(gè)有力手段。
?????? 本研究的第一作者為上海交通大學(xué)李陽(yáng)博士,賴丹昀博士生,華中科技大學(xué)雷清博士生,上海交通大學(xué)許釗葳博士,華中科技大學(xué)汪峰研究員,侯紅艷博士,通訊作者為上海交通大學(xué)陶生策研究員,華中科技大學(xué)范雄林研究員,中山大學(xué)單鴻研究員。
原文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41423-020-00612-5
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稿件來(lái)源:陶生策課題組
圖文編輯:王華瑤
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