[交大智慧]上海交大生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研團(tuán)隊(duì)在中鏈脂肪酸合成硫酯酶的定向設(shè)計(jì)方面取得新進(jìn)展
近日，國(guó)際代謝工程領(lǐng)域重要學(xué)術(shù)期刊《Metabolic engineering》在線發(fā)表上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研團(tuán)隊(duì)最新研究成果“Structure-guided Reshaping of the Acyl Binding Pocket of ‘TesA Thioesterase Enhances Octanoic Acid Production in E. coli”。上海交通大學(xué)博士生鄧茜為第一作者，馮雁教授和楊廣宇研究員為共同通訊作者。
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酰基鏈長(zhǎng)為六到十個(gè)碳原子的中鏈脂肪酸（MCFAs, C6–C10）及衍生物具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。與長(zhǎng)鏈組分相比，中鏈烷烴/烯烴及脂肪酸酯更適合用來(lái)替代汽油等現(xiàn)有化石燃料；中鏈脂肪酸還具有抗菌、免疫調(diào)控等效果，使相關(guān)衍生物廣泛應(yīng)用于食品、藥物生產(chǎn)中。近年來(lái)脂肪酸的微生物合成取得了許多進(jìn)展，但產(chǎn)物中應(yīng)用價(jià)值更高的中鏈脂肪酸含量仍然較低。硫酯酶是脂肪酸合成過(guò)程中鏈長(zhǎng)控制的關(guān)鍵酶，對(duì)硫酯酶進(jìn)行底物選擇性的定向設(shè)計(jì)是提高中鏈脂肪酸合成能力的關(guān)鍵。
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大腸桿菌硫酯酶‘TesA（去除N端信號(hào)肽）是II型脂肪酸合成途徑中應(yīng)用最廣泛的硫酯酶，但該酶底物選擇性寬泛，合成中鏈脂肪酸的能力較弱。研究小組聚焦‘TesA?；Y(jié)合口袋，預(yù)測(cè)與底物結(jié)合密切相關(guān)的熱點(diǎn)殘基；采用半理性設(shè)計(jì)（定點(diǎn)飽和突變和活性中心飽和測(cè)試）策略，利用酯酶底物acyl-pNP進(jìn)行突變庫(kù)的高通量篩選、脂肪酸合成途徑真實(shí)底物acyl-ACP對(duì)優(yōu)異突變體進(jìn)行底物選擇性表征，獲得的最優(yōu)突變體RD-2（M141L/E142D/Y145G/L146K）對(duì)中鏈底物C8-ACP的活性和選擇性比野生型分別提高了8倍和133倍。將最優(yōu)突變體基因引入到脂肪酸合成工程菌中，所獲工程菌的辛酸產(chǎn)量比野生型提高10倍，在5-L發(fā)酵罐中辛酸產(chǎn)量達(dá)2.7 g/L，是目前大腸桿菌II型脂肪酸途徑報(bào)道的最高辛酸滴度。
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研究小組還解析了選擇性發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變突變體的晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)結(jié)構(gòu)比較及動(dòng)力學(xué)模擬分析，發(fā)現(xiàn)突變體?；Y(jié)合口袋底部139–145區(qū)域的顯著構(gòu)象變化重塑了口袋形狀，同時(shí)口袋中部出現(xiàn)明顯的連續(xù)疏水界面。底物對(duì)接結(jié)果表明，連續(xù)疏水界面提高了突變體對(duì)中鏈底物的親和性，而重塑的?；Y(jié)合口袋使長(zhǎng)鏈底物處于扭曲狀態(tài)，不利于酶與底物的結(jié)合，從而降低對(duì)長(zhǎng)鏈底物的催化活性。研究首次證實(shí)了‘TesA?硫酯酶?；Y(jié)合口袋重塑與疏水性提高驅(qū)動(dòng)了突變體底物選擇性的重大轉(zhuǎn)變，將為進(jìn)一步改造SGNH家族硫酯酶提供有力指導(dǎo)。
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該研究建立并成功實(shí)施了針對(duì)硫酯酶底物選擇性的半理性設(shè)計(jì)策略，揭示了‘TesA硫酯酶loop運(yùn)動(dòng)重塑催化口袋的新機(jī)制，為其他硫酯酶的分子改造提供了重要指導(dǎo)，有望進(jìn)一步促進(jìn)微生物細(xì)胞工廠的中鏈脂肪酸合成能力。
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該研究項(xiàng)目獲得科技部（2017YFE0103300）和國(guó)家自然科學(xué)基金（31570788,31670791及21627812）的資助。
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論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.04.010
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