[交大智慧] 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)與合作者揭示細(xì)菌P450催化吡咯并吲哚骨架的立體和區(qū)域選擇性機(jī)制
近日，國際權(quán)威期刊《Nature?Communications》在線發(fā)表了上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院瞿旭東教授與澳大利亞昆士蘭大學(xué)賈新穎博士及Bostjan Kobe教授的合作成果“Molecular Basis of Regio- and Stereo-Specificity in Biosynthesis of Bacterial Heterodimeric Diketopiperazines”，該工作是瞿旭東教授課題組在吡咯并吲哚骨架生物合成領(lǐng)域取得的又一重要突破。瞿旭東教授、昆士蘭大學(xué)賈新穎博士和Bostjan Kobe教授為論文的共同通訊作者，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院博士后孫成海和昆士蘭大學(xué)博士后羅震遙為本文的共同第一作者。
細(xì)菌來源的異源二聚化吡咯并吲哚類生物堿是一類復(fù)雜且生物活性多樣的重要的天然產(chǎn)物。由于該類生物堿核心結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)連續(xù)的叔碳和季碳手性中心，使得化學(xué)合成極具難度，目前尚未有統(tǒng)一高效的化學(xué)合成方法實(shí)現(xiàn)該類生物堿的高效快速合成及結(jié)構(gòu)拓展。為解決這一瓶頸問題，瞿旭東教授課題組另辟蹊徑，采用生物學(xué)方法在該類生物堿的生物合成領(lǐng)域取得了一系列成果。
此前，在研究海洋鏈霉菌Streptomyces sp. CMB-MQ030來源的異源二聚化產(chǎn)物NAS-C的生物合成過程中，瞿旭東教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵P450酶NascB，通過自由基介導(dǎo)的串聯(lián)反應(yīng)，NascB可催化兩分子的含色氨酸的環(huán)二肽（cW-X）以不同方式進(jìn)行異源二聚，同時(shí)該酶具有非常廣泛的底物譜，通過喂養(yǎng)化學(xué)合成的20種cW-Xs，成功創(chuàng)造出了30種具有不同區(qū)域/立體選擇性的異源二聚化產(chǎn)物。相關(guān)研究同樣已發(fā)表在《Nature?Communications》上（2018,?9, 4428. DOI: 10.1038/s41467-018-06528-z）。
在NascB這一關(guān)鍵P450被發(fā)現(xiàn)后，國外一些研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了多項(xiàng)基因組挖掘研究，相繼又發(fā)現(xiàn)了多個(gè)不同P450酶，其可分別催化環(huán)二肽底物產(chǎn)生五種具有不同區(qū)域/立體選擇性的異源二聚化產(chǎn)物；而解決這些發(fā)現(xiàn)背后的更深層次的科學(xué)問題，即P450酶如何調(diào)控反應(yīng)過程中的區(qū)域/立體選擇性，則是本項(xiàng)目的研究目標(biāo)。
該項(xiàng)研究首先通過基因組挖掘及蛋白功能鑒定發(fā)掘三個(gè)與NascB高度同源的三個(gè)P450酶（NasbB，NasS1868 and NasF5053），其中NasS1868 可催化產(chǎn)生異源二聚化產(chǎn)物ASP-A，而NasF5053可以同時(shí)產(chǎn)生ASP-A,?NAS-B和NAS-C。比對NascB、NasS1868 和?NasF5053的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，NasF5053的前112個(gè)氨基酸與NascB完全一致，NasF5053剩余的后半段與NasS1868幾乎完全一致，說明NasF5053前112個(gè)氨基酸中存在調(diào)控NAS-C生成的關(guān)鍵位點(diǎn)，而其后半段存在調(diào)控生成ASP-A的關(guān)鍵位點(diǎn)，為此通過一系列的嵌段突變及單點(diǎn)突變研究，成功發(fā)現(xiàn)四個(gè)氨基酸位點(diǎn)Q65, A86及S284, V288對環(huán)二肽底物的異源二聚化方式存在重要調(diào)控作用；突變體NasF5053-Q65I+A86G只產(chǎn)生NAS-C，而NasF5053- S284A+V288A只產(chǎn)生NAS-C。同時(shí)，通過對這四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變研究，NasF5053- A86K+V288P突變體可催化cW-P底物產(chǎn)生新的異源二聚化產(chǎn)物NAS-E，進(jìn)一步證實(shí)這四個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)控制了反應(yīng)的區(qū)域和立體選擇性。
為深入理解NasF5053催化過程中的分子基礎(chǔ)，本項(xiàng)目昆士蘭大學(xué)合作方解析了NasF5053，NasF5053-Q65I+A86G及NasF5053- S284A+V288A的底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)三者的活性口袋中均有兩分子的底物cW-P，其中一分子底物處于彎曲狀態(tài)，有利于生成吡咯并吲哚稠環(huán)核心骨架，并進(jìn)攻另一分子處于相對舒展?fàn)顟B(tài)的底物生成最終產(chǎn)物，但僅通過這些晶體結(jié)構(gòu)并不能解釋為什么NasF5053能夠產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。為此，本研究進(jìn)一步采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，通過比對NasF5053與NasF5053-Q65I+A86G、NasF5053- S284A+V288A及NasF5053- A86K+V288P的動(dòng)力學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Q65-A86兩個(gè)位點(diǎn)突變后，αB’-αC Loop發(fā)生位移，使得彎曲底物的N10和C2之間距離變大，難以生成NAS-C；而S284-V288兩個(gè)位點(diǎn)突變后，舒展底物周圍的空間變大，舒展底物移向heme活性中心，導(dǎo)致其對彎曲底物的束縛能力降低，彎曲底物移向αI螺旋，剛性隨之變強(qiáng)，N10和C2之間距離變小，只能生成NAS-C。此外，通過統(tǒng)計(jì)比對C2-C3-C12-N10形成的二面角，發(fā)現(xiàn)NasF5053- S284A+V288A中二面角主要為負(fù)值，利于生成NAS-C構(gòu)型；而NasF5053- A86K+V288P中為正值，利于NAS-E的生成。晶體結(jié)構(gòu)學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)結(jié)合，清晰地解釋了P450酶在催化環(huán)二肽底物二聚過程中的調(diào)控機(jī)制。
這項(xiàng)工作系統(tǒng)深入的解析了細(xì)菌P450催化環(huán)二肽底物區(qū)域/立體選擇性二聚的分子基礎(chǔ)，為后期酶工程改造及實(shí)現(xiàn)吡咯并吲哚類生物堿的高效快速合成奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
該項(xiàng)目的研究工作受到了國家自然科學(xué)基金，上海市超級博士后項(xiàng)目以及國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目的支持。
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