生命學(xué)院李雪明課題組與合作者取得了利用軟件配合傳統(tǒng)電鏡解析超高分辨率結(jié)構(gòu)方法的成果
2019年8月1日，清華大學(xué)生命學(xué)院李雪明課題組及其合作者于《分析化學(xué)》 （Analytical chemistry）在線發(fā)表題為《為傳統(tǒng)電鏡編寫程序解析小分子和大分子的超高分辨率結(jié)構(gòu)》 （Programming Conventional Electron Microscopes for Solving Ultrahigh-Resolution Structures of Small and Macro-Molecules）的研究論文。該研究發(fā)布了一款新的MicroED數(shù)據(jù)收集軟件eTasED，可以在傳統(tǒng)的只配備單幀相機(jī)的200kV和120kV透射電子顯微鏡上將多肽和小分子結(jié)構(gòu)解析至約0.6 A，并可以清楚的看到幾乎所有氫原子的密度。該研究去除了MicroED對(duì)具有連續(xù)拍照模式的高端相機(jī)的依賴，證明了120kV低端電鏡在MicroED中的可用性，大大降低了MicroED的設(shè)備成本，提高了該方法的普遍可用性，將有助于MicroED技術(shù)更加廣泛的應(yīng)用。
MicroED技術(shù)近年來(lái)被越來(lái)越廣泛地用于解析蛋白和小分子的晶體結(jié)構(gòu)，但目前所有研究組的MicroED數(shù)據(jù)收集都需要依賴具有連續(xù)拍照模式的高端相機(jī)，以使得在樣品臺(tái)連續(xù)旋轉(zhuǎn)期間相機(jī)能夠連續(xù)拍照，從而避免重構(gòu)出的倒易空間三維點(diǎn)陣產(chǎn)生信息缺失，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)解析誤差。然而除非特殊需要，具有連續(xù)拍照模式的高端相機(jī)一般并不會(huì)安裝在相對(duì)低端的200kV或120kV電鏡上，這就導(dǎo)致若要開展MicroED研究，就需要對(duì)硬件進(jìn)行升級(jí)改造，額外的成本阻礙了MicroED技術(shù)的廣泛應(yīng)用。另外，根據(jù)電子顯微鏡的光學(xué)原理，電子衍射并不會(huì)像圖像那樣受到襯度傳遞函數(shù)（contrast transfer function，CTF）的分辨率約束，所以理論上低端的120kV電鏡也可用于亞埃分辨率水平的電子衍射分析。然而，當(dāng)前絕大多數(shù)MicroED研究都是使用配備場(chǎng)發(fā)射電子槍的200kV透射電鏡做出的，120kV電鏡的可用性也需要探索。
李雪明課題組的研究團(tuán)隊(duì)及其合作者開發(fā)了eTasED軟件，通過軟件來(lái)同步相機(jī)與樣品臺(tái)的行為，使得樣品臺(tái)僅在相機(jī)實(shí)際有效的曝光時(shí)間內(nèi)旋轉(zhuǎn)，其余時(shí)間保持靜止以等待相機(jī)就緒，從而單幀相機(jī)收集的數(shù)據(jù)也能完整地覆蓋倒易空間，而不產(chǎn)生信息缺失。研究團(tuán)隊(duì)使用菊池線這一平移不變的衍射花樣作為標(biāo)尺檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)條件下樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)的穩(wěn)定性，測(cè)試表明，軟件所采用的樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)方式具有較高的穩(wěn)定性，且加速和減速過程極短，在相對(duì)較長(zhǎng)的曝光時(shí)間下其影響可以忽略。借助eTasED軟件，研究團(tuán)隊(duì)使用200kV FEI F20電鏡和120kV FEI T12電鏡將一個(gè)多肽的微晶樣品分別解析至0.65 A和0.60 A，首次在大分子結(jié)構(gòu)中清晰定位全部氫原子，并可以直接觀察到晶體結(jié)構(gòu)中復(fù)雜的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，對(duì)生物大分子的超高分辨率結(jié)構(gòu)研究具有重要意義。此外，研究團(tuán)隊(duì)還將小分子化合物對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen）解析至0.65 A（F20）和0.83 A（T12），將生物素（biotin）解析至0.75 A（F20）和0.90 A（T12）。在0.65 A分辨率的對(duì)乙酰氨基酚結(jié)構(gòu)中也可以直接看到幾乎所有氫原子的密度。該研究降低了MicroED數(shù)據(jù)收集對(duì)硬件的要求，使得研究者可利用身邊現(xiàn)有的硬件，僅通過軟件途徑即可低成本地收集高質(zhì)量的MicroED數(shù)據(jù)，并解析超高分辨率結(jié)構(gòu)，可推進(jìn)MicroED技術(shù)在生命科學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域更加廣泛和深入的應(yīng)用。
清華大學(xué)生命學(xué)院李雪明研究員和中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心的劉聰研究員為本文的共同通訊作者，清華大學(xué)生命學(xué)院2015級(jí)博士生周珩、中科院有機(jī)化學(xué)研究所羅峰博士，清華大學(xué)生命學(xué)院羅智璞博士（現(xiàn)任蘇州大學(xué)分子酶學(xué)研究所教授）為本文共同第一作者。
國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)為本研究的樣品制備和數(shù)據(jù)收集提供了支持。國(guó)家自然科學(xué)基金委、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心為本研究提供了經(jīng)費(fèi)支持。
文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.9b01162
圖1 通過樣品臺(tái)和相機(jī)軟件協(xié)同控制方法獲得衍射數(shù)據(jù)并解析超高分辨率結(jié)構(gòu)的流程示意圖。
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