清華大學醫(yī)學院杜亞楠課題組在Nature Communications發(fā)文報道精確調控細胞在3D多孔生... 時間：2019-08-05
2019年 8月2 日，清華大學醫(yī)學院生物醫(yī)學工程系、清華-北大生命科學聯(lián)合中心杜亞楠研究組于Nature Communications 《自然?通訊》在線發(fā)表了題為“Cryoprotectant enables structural control of porous scaffolds for exploration of cellular mechano-responsiveness in 3D”的研究論文。該研究首次利用冰凍保護劑，對3D多孔生物支架材料的孔徑和硬度實現(xiàn)了獨立和精確的調控，并系統(tǒng)探究了成纖維細胞和巨噬細胞對于材料孔徑和硬度的機械響應特征和相關機制，為基于仿生3D多孔支架材料中的生物力學和組織工程研究提供了有力工具，為精確控制細胞3D微環(huán)境的物理特性提供了理論和實施基礎。
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近年來生物力學領域的快速發(fā)展已證明生物基質材料的物理特性（如硬度）是構成細胞微環(huán)境的重要特性，對細胞表型和功能（如粘附、增殖、遷移、分化、遺傳和表觀遺傳等）的調控至關重要。目前對于生物材料的生物力學研究局限于2D平面材料或僅具有納米孔的3D水凝膠，盡管3D大孔生物支架材料在組織工程和再生醫(yī)學中廣泛應用，至今尚未能對其進行系統(tǒng)性的生物力學研究，這是由于大孔支架材料最主要的兩個物理特性即支架的孔徑和硬度通常相互關聯(lián)，目前的制備手段（如靜電紡絲、冷凍干燥、致孔劑）很難對兩者進行獨立調控以實現(xiàn)單一生物力學特性調控細胞行為的深入研究。
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本研究中，杜亞楠教授課題組發(fā)現(xiàn)引入冰凍保護劑（如DMSO、甘油、甲醇）可對冰晶生長實現(xiàn)有效調控，并利用這一特性實現(xiàn)了對于多孔支架材料孔徑與硬度的獨立調控。研究者發(fā)現(xiàn)，在冷凍過程中，隨著冰晶生長，反應液相中的DMSO被不斷濃縮，導致液相凝固點逐漸降低最終致使冰晶停止生長。理論和實驗數(shù)據(jù)均表明，最初反應液中的DMSO濃度可決定最終形成冰晶的大小?；诖嗽恚ㄟ^調控交聯(lián)劑和冰凍保護劑的用量，可制備出源自各類原料組分（如明膠，透明質酸/明膠復合材料），孔徑范圍在20-80 μm，微觀硬度范圍在20-190kPa的可獨立、精確調控孔徑和硬度的3D多孔支架材料。
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圖1：使用冰凍保護劑控制冰晶生長，實現(xiàn)對硬度和孔徑的獨立、精確調控
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本研究開發(fā)的此種簡單易行的多孔支架制備方法，使得系統(tǒng)研究材料結構和硬度對細胞機械響應成為了可能。成纖維細胞和巨噬細胞是在生長發(fā)育、炎癥反應、損傷修復等生理病理過程中發(fā)揮重要作用的兩類細胞，其對于細胞外基質生物力學性質的響應對于病理研究及植入材料設計都具有重要意義。體外研究發(fā)現(xiàn)，人真皮成纖維細胞在大孔徑-較高硬度（80μm, 190 kPa）的材料中呈現(xiàn)出更激活的狀態(tài)（例如：高表達αSMA），且材料力學和結構性質通過影響轉錄因子YAP的定位來調控成纖維細胞機械響應。巨噬細胞通?？蓸O化為促炎癥反應的M1型細胞和促損傷修復的M2型細胞。研究發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓來源巨噬細胞在小孔徑-較低硬度 (30 μm, 20 kPa)的材料中，傾向于極化為M1表型。相反，在大孔徑-高硬度材料中，巨噬細胞呈現(xiàn)M2型特征。相應的，在小鼠體內皮下植入試驗中，植入小孔徑-低硬度材料，會誘導更多炎性細胞如M1型巨噬細胞及中性粒細胞浸潤，呈現(xiàn)出顯著的促炎效果；在小鼠體內皮膚修復模型中，植入大孔徑-高硬度材料對于皮膚修復愈合速度和纖維化的促進作用最明顯，表明對于損傷修復的促進效果。
圖2：a.體外試驗巨噬細胞在小孔徑低硬度材料中呈現(xiàn)促炎激活表型。b.體內皮膚損傷修復模型中，浸潤的巨噬細胞在小孔徑低硬度材料中呈現(xiàn)促炎激活表型
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研究團隊進一步探索了多孔支架材料孔徑對細胞表型調控的潛在機制。發(fā)現(xiàn)可通過調控培養(yǎng)液滲透壓大小模擬不同孔徑對細胞產(chǎn)生的空間物理限制。在高滲環(huán)境下，普通2D培養(yǎng)和3D大孔徑培養(yǎng)的成纖維細胞和巨噬細胞都呈現(xiàn)出在3D小孔材料中的表型。表明材料孔徑對細胞的機械調控和由孔徑產(chǎn)生的物理限制 (physical confinement）有關。
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本研究首次使用冰凍保護劑調控冰晶生長，從而在多孔生物支架材料中實現(xiàn)了孔徑和硬度的獨立、精確調節(jié)。體外和體內實驗都驗證了多孔支架孔徑和硬度對于細胞機械響應的調控。以上研究結果為3D多孔生物支架材料的生物力學研究提供了有效平臺，同時對調控3D細胞微環(huán)境的物理特性和對于其在組織工程領域中的臨床應用提供了新的設計思路。
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清華大學醫(yī)學院、清華-北大生命科學聯(lián)合中心杜亞楠研究員為本論文的通訊作者，杜亞楠研究組碩士研究生蔣書萌、博士研究生呂丞為本文共同第一作者。清華大學醫(yī)學院石彥教授，夏鐵副研究員在原子力顯微鏡力學表征方面提供了技術支持。美國華盛頓-圣路易斯大學機械工程系的Guy Genin教授在生物力學理論方面給與了支持，北京清華長庚醫(yī)院皮膚科黃晨昱醫(yī)師在皮膚修復方面給與了支持。該研究得到了清華大學實驗動物中心、生物醫(yī)學測試中心的支持。本研究得到了國家自然科學基金委優(yōu)秀青年科學基金、國家重點研發(fā)計劃的資金資助。
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文章鏈接： https://www.nature.com/articles/s41467-019-11397-1
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