清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤課題組發(fā)文首次揭示”局部開(kāi)鏈”與哺乳動(dòng)物ALKBH1催化基因組6mA... 時(shí)間：2020-02-13
2020年2月12日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤研究組在Cell Research期刊以長(zhǎng)文形式報(bào)道了題為“哺乳動(dòng)物ALKBH1是一類非配對(duì)DNA的N6-甲基腺嘌呤去甲基化酶”?（Mammalian ALKBH1 serves as an?N6-mA demethylase of unpairing DNA）的研究論文。該研究通過(guò)建立穩(wěn)定可靠的體外酶活檢測(cè)體系，首次鑒定出ALKBH1為一類局部非配對(duì)DNA的N6-甲基腺嘌呤（6mA）去甲基化酶（圖1）；首次解析了ALKBH1自由態(tài)以及與DNA底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，揭示了ALKBH1偏好局部非配對(duì)核酸底物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為哺乳動(dòng)物基因組第九堿基6mA的調(diào)控生物學(xué)提供了全新的研究視角。
圖1??ALKBH1偏好局部開(kāi)鏈DNA并催化6mA的去甲基化
6mA是哺乳動(dòng)物基因組中除5甲基胞嘧啶及其衍生物（5mC，5hmC，5fC，5caC）之外的又一類表觀修飾，被稱為哺乳動(dòng)物基因組第九堿基?；蚪M6mA的水平在早期胚胎發(fā)育和癌癥發(fā)生等過(guò)程中呈現(xiàn)出劇烈波動(dòng)，其背后的調(diào)控機(jī)制是解碼這一新型修飾堿基生物學(xué)功能的關(guān)鍵。本研究合作者耶魯大學(xué)Andrew Xiao教授實(shí)驗(yàn)室曾在2016年在Nature發(fā)文首次報(bào)道ALKBH1具有DNA 6mA的去甲基化酶活力。但自1996年ALKBH1被克隆以來(lái)，其生理底物一直存在巨大爭(zhēng)議，相關(guān)結(jié)構(gòu)亦未解析，亟待進(jìn)一步研究。
ALKBH1是Fe(II)-α-酮戊二酸雙加氧酶超家族中AlkB家族的成員，與5mC去甲基化酶Tet家族存在很近的親緣關(guān)系。在本研究中，研究者首先建立了基于液相-質(zhì)譜（LC-MS/MS）的定量酶活檢測(cè)體系，系統(tǒng)地檢測(cè)了ALKBH1對(duì)各類核酸底物的去甲基化酶活，發(fā)現(xiàn)ALKBH1偏好催化局部開(kāi)鏈的鼓泡DNA而非單鏈DNA中6mA的去甲基化，且完全無(wú)法催化雙鏈底物的去甲基化（圖2）；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，ALKBH1可以同樣高效催化多種局部非配對(duì)核酸（如bulge、R-loop、D-loop和stem loop等）中6mA的去甲基化，而對(duì)堿基序列沒(méi)有特別偏好，首次闡明了ALKBH1對(duì)底物二級(jí)結(jié)構(gòu)的高度依賴性。同時(shí)，研究者建立的基于寡鏈核酸的質(zhì)譜測(cè)活方法，成功捕獲了6mA去甲基化過(guò)程的中間產(chǎn)物N6-羥甲基腺嘌呤（6hmA），為ALKBH1催化的化學(xué)機(jī)理提供了新證據(jù)。6hmA在非酶促條件下，可以穩(wěn)定存在數(shù)小時(shí)，提示6hmA有可能作為一種亞穩(wěn)態(tài)表觀修飾參與調(diào)控。
圖2??ALKBH1識(shí)別與催化非配對(duì)DNA 6mA去甲基化的生化結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
其它AlkB家族成員以及Tet家族成員均未表現(xiàn)出對(duì)局部非配對(duì)核酸的偏好，那么ALKBH1這種獨(dú)特底物偏好的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是什么呢？如圖2所示，ALKBH1由位于C端的催化結(jié)構(gòu)域（DSBH）、相鄰的底物識(shí)別亞結(jié)構(gòu)域（NRL）以及N端的延長(zhǎng)區(qū)域（NTE）構(gòu)成，其中NRL亞結(jié)構(gòu)域又細(xì)分為Flip1和Flip2兩部分。研究者首先解析了2.5 ?的ALKBH1自由態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其Flip1遠(yuǎn)離酶活中心且外翻伸展，這與其它AlkB家族成員以及Tet2“回扣式”的Flip1構(gòu)象形成了鮮明反差。已有研究表明，“回扣式”Flip1構(gòu)象對(duì)于穩(wěn)定雙鏈DNA修飾堿基外翻，促使其伸向活性中心完成催化有著重要作用。ALKBH1中Flip1的伸展構(gòu)象導(dǎo)致其失去了自主外翻DNA堿基的能力，因此ALKBH1無(wú)法催化雙鏈DNA底物，而其酶活發(fā)揮需要堿基的預(yù)先翻轉(zhuǎn)。
隨后，研究者通過(guò)定點(diǎn)交聯(lián)策略，使原本結(jié)合較弱的ALKBH1和凸起DNA底物形成穩(wěn)定、均一的復(fù)合物，并最終在2.4 ?分辨率水平解析了復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（圖2）。結(jié)果表明，?ALKBH1伸展的Flip1與其N端的α1位于催化中心兩側(cè)，分別與翻轉(zhuǎn)堿基左右兩側(cè)的雙鏈區(qū)域互作。其中，α1和Flip1上的R24和R159殘基分別以“精氨酸手指”方式插入雙鏈區(qū)域的小溝中，協(xié)助將DNA凸起中外翻的修飾堿基呈遞至催化中心實(shí)現(xiàn)去甲基化。復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析突顯了局部非配對(duì)底物雙鏈區(qū)在ALKBH1底物識(shí)別過(guò)程中的關(guān)鍵作用，闡明了ALKBH1偏好催化局部開(kāi)鏈核酸底物而非單鏈底物的原因。研究者進(jìn)一步對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育細(xì)胞進(jìn)行DIP-seq以及ssDNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)N6-mA與基因組的非配對(duì)區(qū)域存在著顯著的共定位，暗示著N6-mA的調(diào)控可能與真核生物染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)，這將為后續(xù)ALKBH1以及N6-mA的功能研究提供全新的視角。
清華大學(xué)李海濤教授和耶魯大學(xué)Andrew Xiao教授為共同通訊作者。李海濤實(shí)驗(yàn)室張敏博士（清華-北京生命科學(xué)聯(lián)合中心2015級(jí)博士研究生）、醫(yī)學(xué)院博士研究生楊舒敏以及耶魯大學(xué)博士研究生Raman Nelakanti為本文共同第一作者。第二作者2018級(jí)PTN聯(lián)合項(xiàng)目博士生趙文濤同學(xué)和清華大學(xué)代謝質(zhì)譜平臺(tái)的劉曉蕙老師為本工作的順利開(kāi)展作出了重要貢獻(xiàn)。
本工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、清華-北京生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心等機(jī)構(gòu)的經(jīng)費(fèi)支持。本課題得到上海同步輻射光源、清華大學(xué)X-ray晶體學(xué)平臺(tái)以及代謝質(zhì)譜平臺(tái)的大力支持與協(xié)助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41422-019-0237-5
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