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2021年3月12日，清華大學醫(yī)學院丁強課題組在《PLOS Pathogens》雜志上在線發(fā)表題為《一種模擬新冠病毒生命周期的新型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)》（A novel cell culture system modeling the SARS-CoV-2 life cycle）的研究論文。該論文首次報道了以核衣殼蛋白反式互補為基礎(chǔ)的SARS-CoV-2遺傳學操作系統(tǒng)，使得對SARS-CoV-2的研究可以在生物安全等級二級（BSL-2）實驗室進行，為病毒學基礎(chǔ)研究、藥物篩選、中和抗體檢測和疫苗評價提供了有力工具。

SARS-CoV-2的爆發(fā)嚴重影響了人們的生產(chǎn)和生活，并奪走了很多人的生命?，F(xiàn)在雖然有緊急批準使用的疫苗，但治療新冠肺炎的特效藥還有待開發(fā)。特別是病毒突變株（例如英國株、南非株和巴西株等）的出現(xiàn)，使得現(xiàn)存疫苗的有效性需要進一步評估。SARS-CoV-2需要在生物安全等級三級（BSL-3）實驗室進行研究，然而BSL-3實驗室數(shù)量有限，這就阻礙了對SARS-CoV-2的基礎(chǔ)病毒學研究以及抗病毒藥物的開發(fā)。

SARS-CoV-2的核衣殼（N）蛋白是病毒顆粒組裝必需的結(jié)構(gòu)蛋白。在本論文中，研究人員將SARS-CoV-2基因組中的N基因刪除，并替換成報告基因（此處為綠色熒光蛋白GFP），將SARS-CoV-2 GFP/del N的cDNA分A-E五個DNA片段擴增（其中A片段上游為T7啟動子），酶切后體外連接，利用T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到SARS-CoV-2 GFP/del N 基因組RNA。研究人員將該RNA轉(zhuǎn)染到病毒包裝細胞系(利用慢病毒轉(zhuǎn)導方法，制備穩(wěn)定表達病毒N蛋白的人來源的Caco-2細胞，命名為Caco-2-N細胞)后，即可產(chǎn)生出N基因缺失的重組病毒。此重組病毒僅可以在表達病毒N蛋白的細胞中完成生命周期，保證了系統(tǒng)的安全性，該實驗體系命名為SARS-CoV-2 GFP/del N VLP（病毒樣顆粒）系統(tǒng)（圖1）。研究人員將SARS-CoV-2 GFP/del N VLP連續(xù)傳代一個月后，通過深度測序沒有檢測到N基因重組到病毒基因組上，說明了該系統(tǒng)的安全性。為了進一步提高系統(tǒng)的安全性，研究人員利用蛋白質(zhì)反式剪切技術(shù)（Intein）將N的cDNA拆成2部分，分別和Intein的N端和C端連接，在兩個獨立載體中表達，進一步降低了N基因和病毒基因組重組的可能。表達后產(chǎn)生的2個蛋白在intein的介導下重組成全長的病毒N蛋白，發(fā)揮其功能。該系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒樣顆粒的感染能力可被新冠中和抗體、可溶性ACE2、干擾素、瑞德西韋以及GC376 (SARS-CoV-2蛋白酶抑制劑)所抑制。該系統(tǒng)為研究N蛋白的功能提供了便利，研究人員發(fā)現(xiàn)SARS-CoV的N蛋白在功能上跟SARS-CoV-2的N蛋白相似，而MERS-CoV的N蛋白則差異較大，為我們理解冠狀病毒的親緣關(guān)系提供了重要依據(jù)；同時，研究人員利用該系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)N蛋白特定位點（S188和S206）的磷酸化修飾對N蛋白發(fā)揮功能至關(guān)重要。最后，研究人員利用該系統(tǒng)建立了藥物高通量篩選平臺，從約400種化合物中找到了5種能夠高效抑制SARS-CoV-2重組病毒感染的化合物，并在真病毒感染情況下驗證了其效果。

除此之外，丁強課題組與清華大學生命科學學院張強鋒課題組合作，利用SARS-CoV-2 GFP/del N VLP系統(tǒng)證明了SARS-CoV-2基因組RNA二級結(jié)構(gòu)的重要功能，并且篩選到了靶向宿主蛋白的抗病毒藥物¹；丁強課題組還與上?？萍即髮W黃行許課題組合作，利用SARS-CoV-2反式互補系統(tǒng)，證明病毒核衣殼N蛋白可以跟宿主G3BP蛋白發(fā)生相變，從而解聚應激顆粒，促進病毒感染²。目前，丁強課題組正在和清華以及其他科研單位的課題組進行合作，利用該系統(tǒng)開展創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)以及病毒和宿主相互作用的研究。

綜上所述，SARS-CoV-2 GFP/del N VLP為研究SARS-CoV-2基礎(chǔ)病毒學，解析病毒與宿主相互作用，評價抗病毒藥物和中和抗體效果以及新藥開發(fā)提供了重要的研究工具（圖1）。

清華大學醫(yī)學院博士生鞠曉輝為該論文的第一作者，復旦大學朱云凱、王玉燕和清華大學張佳星、龔明麗、任文琳等參與了此工作，論文的其他作者還包括巴斯德研究所鐘勁教授、清華大學醫(yī)學院張林琦教授、清華大學生命科學學院李賽研究員和張強鋒研究員。中國農(nóng)業(yè)大學李景睿副教授和復旦大學張榮研究員對該研究做出了重要貢獻，清華大學醫(yī)學院丁強研究員為論文的通訊作者。該研究由北京市自然科學基金、清華-北大生命科學聯(lián)合中心、清華大學自主科研計劃以及清華大學高精尖中心等資助完成。

論文鏈接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1009439

參考文獻：

1. Sun L*, Li P*, Ju X*, Rao, J*, Huang, W*, et al. In vivo structural characterization of the SARS-CoV-2 RNA genome identifies host proteins vulnerable to repurposed drugs. Cell, 2021. (* co-first author)

2. Luo L*, Li Z*, Zhao T*, Ju X*, et al. SARS-CoV-2 nucleocapsid protein phase separates with G3BPs to disassemble stress granules and facilitate viral production. Science Bulletin, 2021. (* co-first author)