最新研究成果 | 清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏課題組在《Cell Discovery》發(fā)表基于化學(xué)手段實(shí)現(xiàn)從小鼠到非人靈長(zhǎng)類的全身蛋白敲低
時(shí)間：2021-04-09 00:39:04學(xué)院：藥學(xué)院學(xué)校：清華大學(xué)
2019年2月5日，清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏課題組與中科院生物物理研究所姬廣聚組及北京大學(xué)肖瑞平、張秀琴組合作在Cell discovery《細(xì)胞發(fā)現(xiàn)》期刊在線發(fā)表了最新研究成果《基于化學(xué)手段實(shí)現(xiàn)從小鼠到非人靈長(zhǎng)類的全身蛋白敲低》（A Chemical Approach for Global Protein Knockdown from Mice to Non-human Primates）。該論文通過化學(xué)設(shè)計(jì)蛋白降解分子（PROTACs），快速可逆敲低動(dòng)物體內(nèi)蛋白（FKBP12），并首次成功實(shí)現(xiàn)恒河猴體內(nèi)蛋白快速敲降。
動(dòng)物的基因敲除是常見的研究手段之一。目前，常見的敲除手段如TALEN，Cre-LoxP，CRISPR-Cas9等是從基因組進(jìn)行敲除，RNA干擾的方式則是從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行敲降。而這些方法通常在構(gòu)建大動(dòng)物基因敲除模型，尤其是非人靈長(zhǎng)類上仍存在很大難度。此外，這些方法構(gòu)建模型通常需要較長(zhǎng)時(shí)間，且基因敲除引起的功能喪失多是不可逆的。而且基因敲除模型中潛在的基因補(bǔ)償和/或自發(fā)突變可能導(dǎo)致功能誤讀。某些特定基因的全身性敲除會(huì)出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常甚至死亡的現(xiàn)象，影響出生后的實(shí)驗(yàn)研究。
PROTAC（Proteolysis-Targeting Chimera）技術(shù)通過招募E3泛素連接酶，利用自身的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向特定蛋白的降解。FKBP12（FK506 binding protein 12）是能與大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑FK506和雷帕霉素特異性結(jié)合，并在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)的一類蛋白，該蛋白與鈣離子通道受體-蘭尼堿受體結(jié)合，使鈣離子通道處于穩(wěn)定的關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)FKBP12從RyRs解離后，RyRs開放，釋放鈣離子，從而通過鈣信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體重要功能的調(diào)控。FKBP12重要功能之一是參與心臟發(fā)育，對(duì)心肌細(xì)胞表型分化、心臟結(jié)構(gòu)形成和心臟搏動(dòng)的啟動(dòng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。胚胎期心臟缺失FKBP12時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的發(fā)育性心室缺損，導(dǎo)致胚胎死亡。因此全身敲除FKBP12在成年鼠心臟中的功能研究還不完全，且并沒有敲除大動(dòng)物FKBP12的研究。
哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院魏文毅教授在Cell Research期刊上評(píng)論該工作時(shí)指出由于PROTAC技術(shù)是直接通過內(nèi)源E3連接酶和泛素化系統(tǒng)將引起癌癥的靶蛋白降解，因此該技術(shù)可以克服傳統(tǒng)方法如CRISPR, RNAi和小分子抑制劑的不足，是引領(lǐng)新一代醫(yī)藥開發(fā)的新技術(shù)。目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)第一例口服PROTAC(ARV-110)進(jìn)入臨床一期研究，通過降解雄激素受體治療前列腺癌。但目前缺乏對(duì)PROTAC的系統(tǒng)研究及動(dòng)物層面的臨床前研究，尤其是大動(dòng)物上的評(píng)價(jià)。所以該工作實(shí)現(xiàn)了PROTAC技術(shù)從小鼠、豬到恒河猴的系統(tǒng)探索，填補(bǔ)了PROTAC技術(shù)臨床前研究的空白，為其應(yīng)用于臨床治療人類腫瘤提供了指導(dǎo)，奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)為體內(nèi)蛋白功能研究提供了一種新穎、高效、快速、可逆且低成本的強(qiáng)有力工具。
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清華大學(xué)饒燏教授和姬廣聚教授，張秀琴教授為本論文共同通訊作者。饒燏課題組、清華-北大生命聯(lián)合中心博士后孫秀云、中科院生物物理所博士生王珺及饒燏課題組博士生姚霞為本文并列第一作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目的大力支持。
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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-018-0079-1
動(dòng)物的基因敲除是常見的研究手段之一。目前，常見的敲除手段如TALEN，Cre-LoxP，CRISPR-Cas9等是從基因組進(jìn)行敲除，RNA干擾的方式則是從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行敲降。而這些方法通常在構(gòu)建大動(dòng)物基因敲除模型，尤其是非人靈長(zhǎng)類上仍存在很大難度。此外，這些方法構(gòu)建模型通常需要較長(zhǎng)時(shí)間，且基因敲除引起的功能喪失多是不可逆的。而且基因敲除模型中潛在的基因補(bǔ)償和/或自發(fā)突變可能導(dǎo)致功能誤讀。某些特定基因的全身性敲除會(huì)出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常甚至死亡的現(xiàn)象，影響出生后的實(shí)驗(yàn)研究。
PROTAC（Proteolysis-Targeting Chimera）技術(shù)通過招募E3泛素連接酶，利用自身的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向特定蛋白的降解。FKBP12（FK506 binding protein 12）是能與大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑FK506和雷帕霉素特異性結(jié)合，并在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)的一類蛋白，該蛋白與鈣離子通道受體-蘭尼堿受體結(jié)合，使鈣離子通道處于穩(wěn)定的關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)FKBP12從RyRs解離后，RyRs開放，釋放鈣離子，從而通過鈣信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體重要功能的調(diào)控。FKBP12重要功能之一是參與心臟發(fā)育，對(duì)心肌細(xì)胞表型分化、心臟結(jié)構(gòu)形成和心臟搏動(dòng)的啟動(dòng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。胚胎期心臟缺失FKBP12時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的發(fā)育性心室缺損，導(dǎo)致胚胎死亡。因此全身敲除FKBP12在成年鼠心臟中的功能研究還不完全，且并沒有敲除大動(dòng)物FKBP12的研究。
圖1. PROTACs原理示意圖及所設(shè)計(jì)分子活性測(cè)定
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在本文中，首次利用PROTACs這一化學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)靶蛋白的全身敲低，快速構(gòu)建了小鼠、大鼠、豬和恒河猴的FKBP12蛋白全身敲低模型，并在小鼠及恒河猴對(duì)FKBP12蛋白功能進(jìn)行了研究和驗(yàn)證。其中小鼠及大鼠體內(nèi)FKBP12蛋白僅用一天，香豬體內(nèi)FKBP12僅用兩天，恒河猴體內(nèi)FKBP12僅用三天即可全身高效率全身敲低。此外，本文中首次驗(yàn)證PROTACs可在口服給藥途徑中保持高效蛋白降解功能。腦室給予PROTACs時(shí)可實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)FKBP12的條件性敲除。若停止給予PROTAC，則動(dòng)物體內(nèi)蛋白可逐漸恢復(fù)，這有利于動(dòng)物模型自身對(duì)照，對(duì)于蛋白功能研究更為準(zhǔn)確。本文還將此方法應(yīng)用于其他靶蛋白的全身敲低，如BTK蛋白。因此，該P(yáng)ROTAC技術(shù)是當(dāng)前基因敲除方法的有效補(bǔ)充，因其快速可逆可控實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外蛋白全身敲低，是極有應(yīng)用前景。?
圖2. 利用所設(shè)計(jì)PROTAC對(duì)恒河猴FKBP12全身敲低及停藥后蛋白恢復(fù)
?哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院魏文毅教授在Cell Research期刊上評(píng)論該工作時(shí)指出由于PROTAC技術(shù)是直接通過內(nèi)源E3連接酶和泛素化系統(tǒng)將引起癌癥的靶蛋白降解，因此該技術(shù)可以克服傳統(tǒng)方法如CRISPR, RNAi和小分子抑制劑的不足，是引領(lǐng)新一代醫(yī)藥開發(fā)的新技術(shù)。目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)第一例口服PROTAC(ARV-110)進(jìn)入臨床一期研究，通過降解雄激素受體治療前列腺癌。但目前缺乏對(duì)PROTAC的系統(tǒng)研究及動(dòng)物層面的臨床前研究，尤其是大動(dòng)物上的評(píng)價(jià)。所以該工作實(shí)現(xiàn)了PROTAC技術(shù)從小鼠、豬到恒河猴的系統(tǒng)探索，填補(bǔ)了PROTAC技術(shù)臨床前研究的空白，為其應(yīng)用于臨床治療人類腫瘤提供了指導(dǎo)，奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)為體內(nèi)蛋白功能研究提供了一種新穎、高效、快速、可逆且低成本的強(qiáng)有力工具。
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圖3. 從DNA, RNA和蛋白質(zhì)水平抑制腫瘤相關(guān)基因的策略總結(jié)
清華大學(xué)饒燏教授和姬廣聚教授，張秀琴教授為本論文共同通訊作者。饒燏課題組、清華-北大生命聯(lián)合中心博士后孫秀云、中科院生物物理所博士生王珺及饒燏課題組博士生姚霞為本文并列第一作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目的大力支持。
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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-018-0079-1
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